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【原创】关于分光光度计基线校正的原理和方法

紫外可见分光光度计(UV)

  • 对于双光束分光光度计而言在使用前必须要做基线校正(也称为基线记忆),对于此项工作的原理和操作方法许多使用者的认识不尽相同;为此谈谈我的认识。
    (一)为何要做基线校正?
    众所周知、光度计的光学系统基本是由光源(氘灯、钨灯)—单色器(光栅、狭缝)—检测器(硅光二极管、光电倍增管)等三部分组成的。在我们使用的波长区域中(一般紫外可见仪器均在190nm~1100nm范围里,)上述部件在不同的波长下的响应值(光源的发射强度、单色器的色散强度、检测器的放大倍数)均不相同;通俗地说、即使没有样品,仪器如果不做基线校正,那么在190nm至1100nm的范围中,吸光值或透过率不会是一条直线,这是一种客观的物理现象,如下图;


    尽管上图反映的是单光束的能量图,但在基线未校正状态下,即使改用双光束测量方式来扫描一个样品,其所得到的图谱或吸光值也是不可信的。
    (二)被校正的基线种类和用途
    (1)系统基线:
    所谓系统基线就是仪器固有的波长范围的总基线;例如一台仪器出厂设计的波长全程范围是190nm至1100nm,那么它的系统基线就是这个范围。一般来讲,作为分析人员对一台仪器做全程扫描测试是比较少见的;之所以要做系统基线的目的一般是将仪器的光学系统的响应值校正到基本一致;这就类似马拉松赛跑一样,只要大家在同一起跑处(注意:不是起跑线)比赛,前后差几米出发无所谓。
    (2)用户基线:
    所谓用户基线就是分析者自己设定的测量波长区域的一段基线;由于这是分析所需要的区域,为了保证测试的准确性,故用户基线的校正是非常重要和必要的;这就类似百米赛跑一样,运动员要在同一个起跑线上比赛而不能抢跑,否则无法准确计算成绩。
    (三)基线校正的方法
    (1)系统基线:
    系统基线的校正较为简单,一般情况下样品室内不放样品,仅做光学系统的校正;如果一定要使用全波段的测量那另当别论。同时需要注意的是:系统基线无需经常校正,一般半个月或一个月校正校正一次即可。对有的仪器来说,系统基线校正过于频繁反而会造成基线漂移严重。
    (2)用户基线校正:
    正确的校正方法是:两只比色杯盛有空白溶液分别放置在样品及参比光路中,校正波长范围要大于分析波长范围;例如、分析设定范围为220nm~500nm,那么校正波长就要设定为210nm~510nm;等待校正结束后再将波长设定回到原来的220nm~500nm范围。这种校正方法的优点是:如果校正波长与分析波长完全吻合一致,有可能在校正后的基线两端出现大的噪声;如果校正范围大于实际分析范围并掐头去尾后可以提高分析精度。我将这种校正方法起名为“豆芽菜原理”,目的是便于记牢;(因为我们吃豆芽菜时均要掐头去根,仅吃中间部分,故以前的饭馆将炒豆芽这道菜称为“炒掐菜”;对不起、跑题了)。关于这种校正方法,许多使用者往往不知晓或忽略掉了,在此顺便介绍给版友。
    值得注意的是,有的仪器操作者在做基线校正时,参比一侧不放参比溶液,也就是用空气来做参比对照。这种方法在可见区对有的样品也许有时影响不大,但在紫外区影响就会很明显了。严格的说,用空气做参比所测得的结果不是真正意义上的校正光谱。
    (四)基线校正的注意事项
    (1)基线校正时要保证仪器有一定的预热时间
    (2)每更换一种参比溶液后均要重新做基线校正
    (3)如果参比溶液的吸光度大于样品的吸光度值时测试结果会出现负值,此时要考虑使用何种溶液做基线校正了。
    (4)做基线校正时要考虑试剂的使用波长范围问题,因为有的试剂在某个波长以下的吸光度值会无限大,这时去做校正会超出仪器的有效量程范围,无法得到真正的结果。关于试剂的使用波长范围,目前一般在试剂瓶的标签上会有标注。我有个简单资料表供大家参考如下:

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  • 初学者&九点虎

    第1楼2008/11/15

    分析设定范围为220nm~600nm
    用户基线校正里是不是应该是220nm~500nm???
    比对照
    是不是应该是参比对照???
    给anping老师挑错呢,嘿嘿

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  • 初学者&九点虎

    第2楼2008/11/15

    疑问1:对空气参比有一个疑问,空气对紫外的吸收只是在末端,一般在190-210之间,即使样品和参比都放了溶液,空气对紫外的吸收也是存在的,对吗?要消除这种情况,只能做真空紫外了,对吗?这对普通用户来说,我个人感觉意义不大。所以在普通校正中,如果不用到210一下,是不是参比不放溶液对结果的影响很小呢?
    疑问2:如果参比槽放空白,样品槽放样品溶液,这样做波长扫描出来的谱图是不是就可以扣除背景的干扰呢?

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  • yuduoling

    第3楼2008/11/15

    不错的资料,非常感谢

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  • 夕阳

    第4楼2008/11/16

    应助达人

    谢谢版主的“挑刺”!太及时了!
    版主真细心,的确是我的笔误。下次一定注意了。

    zhouyuhu 发表:分析设定范围为220nm~600nm
    用户基线校正里是不是应该是220nm~500nm???
    比对照
    是不是应该是参比对照???
    给anping老师挑错呢,嘿嘿

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  • 初学者&九点虎

    第5楼2008/11/16

    哈哈,anping老师的大作当然要认真学习了,在学习您帖子的过程中,俺不断的成长。
    嘿嘿,只能挑点笔误了,别的知识性很强,只有学习的份了

    anping 发表:谢谢版主的“挑刺”!太及时了!
    版主真细心,的确是我的笔误。下次一定注意了。

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  • 夕阳

    第6楼2008/11/17

    应助达人

    回答版主的疑问如下:
    疑问1:
    的确、空气对紫外光谱的吸收是有影响的。据我们到西藏出差回来的同事讲,他们在当地使用原吸时,在同样的条件下(包括灯、波长、仪器等),在北京如果将灯电流调到7mA后使透过率达到100%的话,到西藏只要将灯电流调到3~4mA就可以达到同样效果;可见空气的稀薄程度对于吸光度是有影响的。但是我们在紫外区做基线校正不是针对空气的影响,因为在同一地点的空气影响是可以忽略的。之所以做基线校正,主要是溶剂的影响;参考我在帖子里给出的一些溶剂使用的波长范围表,其中绝大部分使用波长范围均在210nm以上,并不是楼主所说的仅在“190~210nm”的范围中校正才有意义。
    疑问2:
    用空白溶液做了基线校正后,仅仅是克服了空白溶液所产生的误差;至于样品的“背景”问题就很复杂了,当然、空白溶液也是背景之一。但我个人认为真正样品中的背景问题需要具体事物具体分析了。

    zhouyuhu 发表:疑问1:对空气参比有一个疑问,空气对紫外的吸收只是在末端,一般在190-210之间,即使样品和参比都放了溶液,空气对紫外的吸收也是存在的,对吗?要消除这种情况,只能做真空紫外了,对吗?这对普通用户来说,我个人感觉意义不大。所以在普通校正中,如果不用到210一下,是不是参比不放溶液对结果的影响很小呢?
    疑问2:如果参比槽放空白,样品槽放样品溶液,这样做波长扫描出来的谱图是不是就可以扣除背景的干扰呢?

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  • colourwolf_800

    第7楼2008/11/17

    学习中,支持。

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  • plz

    第8楼2008/11/17

    想讨教测定食品中的氟,波长应该是多少?谢谢。

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  • zhw1112

    第9楼2008/11/17

    非常感谢!很有帮助

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  • 青山依旧

    第10楼2008/11/17

    很好,正想找这方面的资料。谢谢!

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