【分享】欧盟兽药检测方法（之二）

7 仪器设备
7.1 离心机。
7.2 旋转蒸发器。
7.3 水平振荡器。
7.4 Stomacher（Cofralab-07555526）和塑料袋（Cofralab-07556952）。
7.5 超声波水浴。
7.6 搅拌机或碎肉机。
7.7 真空过滤系统（Vac-Elut from Analytichem International）。
7.8 超声波探头（Cofralab-07580740）。
7.9 磁搅拌器或磁振荡器。
7.10 衍生反应用的圆锥型反应小玻璃瓶 。
7.11 加热圆锥型反应小玻璃瓶（7.10）用的加热块。
7.12 配有吹氮气装置的旋转蒸发系统。
7.13 固相提取柱（SPE-柱）：CLEAN SCREEN DAU IM6（Worldwide monitoring - Horsham, PA, USA and sold by Technicol, Stockport, Cheshire, UK）。这些柱子含有1000 mg的混合相担体，具有憎水性和离子交换的性质。
7.14 GC-MS。
7.14.1 气相色谱仪：HP 5890。
毛细管色谱柱：30 m 0.25 mm内径，具有0.25 m膜厚的SE-30固定相。
进样模式：不分流进样超过1min。
进样体积：2 L。
进样器温度：250℃；接口温度：280℃。
升温程序：
70℃（2min） 18℃/min 200℃（0min） 5℃/min 245℃（0min）25℃/min 300℃（12 min）
载气:高纯氦，流量1 mL/min；压力5 psi。
7.14.2 质谱仪（MS）：HP 5971，具有UNIX计算机工作站。
电子轰击离解模式：70 eV。
离子源温度：190℃ 5℃。
离子源真空度：30-40毫乇。
离子质量：见表1。

表 1
-激动剂的名称 N RT（分） 选择离子 分子离子
Tulobuterol 1 9.34 86,194,284 299
Mabuterol 1 10.36 86,277,296 382
Mapenterol 1 11.04 100,277,296 396
Terbutaline 3 11.67 86,356 441
Clenbuterol 1 12.02 86,243,262(264) 348
Cimaterol 1 12.14 72,219 291
Salbutamol 3 12.27 85,369 455
Cimbuterol 1 12.36 72,291 305
Cimaterol 2 12.62 27,223 363
Metoprolol(I.S) 1 12.7 86,291 339
Cimbuterol 2 12.8 100,243,262(264) 377
Clenpenterol 1 12.86 174,243,262 362
Hydroxymethyl-
clenbuterol(NA
1141) 2 14.05 322,256,412 436
Fenoterol 4 18.39 250,267 591
Ractopamine 3 18.63 517
表中的N代表三甲基硅烷基的数目，RT是在LDH，Nantes所做的一次分析中记录
到保留时间。


8 样品和取样程序
注意：留意6.3.1节和国际标准化组织文件78/2-1982（E）以及由文件2052/Ⅵ/84-EN 的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 样品性状:即必须符合导则64/433/EEC中定义的内容，使能够进行肝、肾和肉样中残留物的测定。
8.2 样品量:样品量要大到足以完成测定以及重复测定的要求。本方法测定β-激动素作一次测定时所要求的样品量为10g。
8.3 样品采集和包装的方法:必须使实验室易于鉴别和使用。
8.4 样品的包装、贮存和运输的方法:必须保证样品的完整性，不能影响测试的结果。
在48小时内就做 -激动素分析的样品，必须贮存于冰箱内。48小时以后才做分析的样品，必须在低于-18℃的温度下贮存。

9 操作步骤
9.1 分割约15g的初级样品，放进一台搅拌机或碎肉机中，使样品绞碎。但对肝样品来说，可不必这样做。
9.2 称出10 1 g的碎样，放入一个Stomacher口袋中，加进去15 mL pH=5.2的乙酸盐缓冲溶液（6.3.3），均质5分钟。
9.3 将袋中内容物转移到一个25 mL的烧瓶中。
9.4 将超声波探头（7.8）伸进烧瓶中，超声0.5秒钟，等待5秒钟后再超声0.5秒钟。对肝和肾样品重复这一操作10次（总时间为50秒），对肉样品重复这一操作20次（总时间为100秒）。
9.5 添加120 ng的metoprolol作为内标物质加入肝、肾和肉样中，包括空白的肝、肾和肉的样品，含量相当于12 g/kg样品。
9.7 取出一个肝、肾和肉的空白样品，添加120ng的metoprolol标准物质（相当于样品中含量为12 ppb），80 ng的tulobuterol, fenoterol, 和ractopamine标准物质（相当于样品中含量为8 ppb），40 ng的其它 -激动剂标准物质（相当于样品中含量为4 ppb）。
9.8 加50 L的Helix pomatia果汁（6.2.1），放置于50℃（42 52℃）的水浴中或烘箱内，放置过夜。
9.9 将经过水解的肝、肾和肉样品转移到一个聚乙烯离心管中。
9.10 加入10 mL 0.1 mol/L的高氯酸（6.3.6），混合均匀并用70 的高氯酸（PCA）（6.3.15）调节pH值到1 0.3。
9.11 以7000转/分的转速离心25分钟后，将上清液转移到一根玻璃离心管中。
9.12 用氢氧化铵溶液（6.2.6）调节pH值到9.5 0.3。
9.13 用氯化钠饱和水相。
9.14 加25 mL 的异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液（6.3.8），置于一个水平振荡器上振荡15分钟。
9.15 以3000-4000转/分的转速离心15分钟。
9.16 转移有机相到一个250 mL的旋转蒸发烧瓶中。
9.17 再用15 mL的异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液（6.3.8），提取水相一次，合并有机相。
9.18 在一个旋转蒸发器上，以45 5℃的温度，蒸发有机相至干。
9.19 以8 mL的磷酸盐缓冲溶液（6.3.4）使蒸发残渣成为悬浮液后，转移到一根溶血用的试管中，再用 4 mL的磷酸盐缓冲溶液洗涤烧瓶后，并入刚才的溶血用的试管中。
9.20 以2000-3000转/分的转速离心15分钟。
注意：这一步操作是很重要的，当旋转蒸发操作之后出现了固体残渣时。
9.21 将液相倾入一根试管中，再加入3mL磷酸盐缓冲溶液（6.3.4）。
9.22 固相提取（SPE）柱提取。
9.22.1 将色谱柱至于一种真空洗脱系统之上，分别用4mL甲醇，4mL水（6.2.3）和4mL磷酸缓冲溶液（6.3.4）依此洗涤柱子。
9.22.2 用巴氏消毒的移液管，将清亮的提取溶液转移至色谱住的顶部，稍微施加一点负压（约为5cm Hg柱）小心缓慢地抽吸色谱柱。此步操作至少需要10 分钟。
9.22.3 用40 cm Hg柱的负压，2 mL 1M的乙酸（6.2.8）洗涤柱子到干后至少15分钟，
最后用12 mL甲醇和较强的负压洗涤柱子至干后至少10分钟。
9.22.4 在进行9.22.3步的操作期间，将乙酸乙酯和氢氧化铵混合溶液（6.3.5）放在一个超声波水浴中混合均匀待用。
9.22.5 用12 mL上一步混合均匀的乙酸乙酯和氢氧化铵混合溶液，洗脱柱子上的待分析成分。
9.23 通氮气在温度为40 5℃的加热块上蒸发洗脱液。
9.24 加入200 L甲醇，剧烈涡流摇动，溶解蒸发残渣。
9.25 将溶液转移至一个反应玻璃小瓶中。
9.26 再用100 L甲醇溶解上一步未溶解完全的残渣，溶液合并进反应玻璃小瓶中。
9.27 在温度为40 5℃的加热块上蒸发甲醇至干。
9.28 衍生化反应。
9.28.1 加入50 L的N-O-双-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA），并剧烈涡流摇动。
9.28.2 将反应小瓶放置在75 5℃ 的加热块上放置90 15分钟。
9.28.3 将反应小瓶转移至一个温度为40 5℃ 的加热块上，让小瓶和加热块冷却到室温（25℃）后，通氮气流蒸发至干。
9.28.4 加入25 L甲苯（6.2.10）剧烈涡流摇动溶解蒸发残渣。
9.28.5 小瓶可以贮存于温度为 +4 ℃的冰箱内。
9.29 注射2 L上一步操作中的溶液进入GC-MS。
9.30 GC-MS仪器分析系统。
GC-MS仪器分析系统以选择性离子监视运行， -激动剂衍生物的保留时间列举在7.14.2的表1中。

10 对结果的分析
10.1 分析结果的合法性；欧共体第256号决议中关于结果的标准表述都应该做到，尤其是对下列内容。
10.1.1 在适当基质中标准被分析物的三甲基硅烷衍生物，与被怀疑的相应的 -激动剂的三甲基硅烷衍生物，它们的相对保留时间，必须是相同的。
10.1.2 被选择离子对基峰的相对丰度，与空白肝、肾和肉样中添加的标准物的相应离子对基峰的相对丰度，必须是相同的。
10.1.3 内标标准物的离子（metoprolol-单体三甲基硅烷衍生物离子），必须出现在正确的相对保留时间的位置上。
10.1.4 添加有内标标准物的空白肝、肾和肉样的分析结果，必须确保没有来自GC-MS系统中残留 -激动剂的任何贡献，即 -激动剂的含量不能超过添加量。这也是对系统是否有污染的一种考核。

11 特殊事例

12 方法注意点

13 质量控制
参看关于 -激动剂的RMs详细手册的第8节的内容。

14 检验报告

15 缩略语列表
一分全面的缩略语列表放在附件I的第12节。

16 实验流程图

肝,肾,肉样品 (均质) ——————→ 高氯酸沉淀 ——————→ 提取

1.溶剂液液分配萃取
2. 固相提取柱色谱

计算结果 ←——— GC-MS ←——— 三甲基硅烷化衍生