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9.操作步骤
9.1提取步骤
[注意:样品回收率测定时:3H-玉米赤霉醇在提取样品前加入,然后用RIA测定提取液中的回收率。]
9.1.1尿液和胆汁
本法测得的玉米赤霉醇为样品的总浓度。试样中共轭态的玉米赤霉醇通过水解成游离型,然后提取至乙醚中。提取液由HPLC净化,随后RIA测定。
9.1.2在试剂瓶(7.7.3)中加入2.0mL重蒸馏水(6.1.4)和0.1mL 3H玉米赤霉醇回收液(6.4.1)。
9.1.2.1各加入0.1mL回收液(6.4.1)至2个闪烁瓶中(7.8)。
9.1.3加入0.05mL胆汁或尿液(如果玉米赤霉醇浓度很高,减量加入。所有样品平行测试2次)。
9.1.4另取2个试剂瓶(9.1.2)各加入0.05mL质控尿液或胆汁(6.2.3.1或6.2.3.2)。
9.1.5两个试剂瓶(9.1.2)作为溶剂空白。
9.1.6各加100 L酶(6.2.2)于上述试剂瓶(9.1.3 – 9.1.5)中, 在37℃中培养2h。
9.1.7冷却后加入5mL乙醚(6.1.3),振荡15秒。
9.1.8在干冰/丙酮浴中(6.1.1,6.1.2)冷冻样品,醚相转移至玻璃试管中。
9.1.9蒸发至干(7.11.1)。
9.1.10 HPLC步骤。
9.1.10.1用0.25mL甲醇/水(30:70,V/V)溶解残渣。
9.1.10.2溶解提取物(9.1.10.1)经HPLC净化。
9.1.10.3 甲醇/水(60:40,V/V)作流动相,流速1 - 2 mL/min。
9.1.10.4 收集保留时间为5 min前后的馏分。在提取液(9.1.10.1)进样前,应预先测定玉米赤霉醇及相关化合物的保留时间。玉米赤霉醇与相关化合物应完全分离。
HPLC注意事项:
1.对组织提取物,先经Sep-Pak C18小柱净化,再用HPLC净化,这样可保护HPLC柱。
2.馏分可手动收集,或通过自进样至馏分收集器的电脉冲进行收集。
9.1.10.5 将单馏分收集的溶剂挥发。
9.1.11 加1.0 mL缓冲液(6.5.4),旋涡混匀。
9.1.12 按9.3.17 - 9.3.21步骤进行。
9.2 粪便
方法原理是用乙醚从粪便中提取游离的玉米赤霉醇,醚提取物再经液-液分离,纯化,RIA测定。
9.2.1 分别称取两份1g粪便样于试剂瓶中(7.7.3)。
9.2.2 称取两份1g质控粪样(6.3.5)于通用瓶中。
9.2.3 各加5 mL 水于2个通用瓶和试剂瓶(9.2.1和9.2.2)中。
9.2.4 各加0.1 mL玉米赤霉醇回收液(4.1)于通用瓶(9.2.1,9.2.2和9.2.3)中,旋涡混匀15s。
9.2.4.1 各加0.1 mL玉米赤霉醇于两个闪烁瓶(7.8)中。
9.2.5 加10 mL 乙醚,旋涡混匀15s。在2000 - 3000 rpm离心10min。
9.2.6 在干冰/丙酮浴(6.1.1,6.1.2)中冷冻试剂瓶,醚相转移至玻璃锥形离心管(7.7.2)中。
9.2.7 融化水相,重复9.2.5和9.2.6步骤。
9.2.8 合并乙醚相,挥发至干(7.11.1)。
9.2.9 残留物用1 mL氯仿(6.3.1)溶解。
9.2.10 用1 3 mL 1M NaOH(6.3.2)溶液抽取氯仿中的玉米赤霉醇.旋涡混匀15s。在1000 rpm离心10 min。吸取上层NaOH相至通用瓶(7.7.3)中。
9.2.11 重复9.2.10步骤。
9.2.12 合并NaOH提取液,用0.6 mL 90% HAc(6.3.3)酸化。
9.2.13 用1 10 mL乙醚抽提水相中玉米赤霉醇。在干冰/丙酮浴(9.2.6)中通过冰冻分离醚相。如有需要,在冰冻前可适当旋涡混匀和离心。
9.2.14 合并乙醚提取物,挥发至干 。
9.2.15 HPLC步骤(见9.1.10 - 9.1.10.5)。
9.2.16 加1 mL甲醇(6.3.4)将残留物溶解。
9.2.16.1 移取0.2 mL至闪烁瓶中(7.8)中,回收测定按9.3.16 - 9.3.18步骤。
9.2.17 配制1/50 - 1/10样品,用作RIA测定。
9.2.17.1 移取0.1mL甲醇提取物(9.2.15)至硅化的玻璃试管(7.7.4)中,氮气流下吹干。加0.5 mL缓冲液(6.5.4),进行RIA步骤(9.5.1 - 9.5.10)。
9.3 肉、肝、肾
本法基于醚对肉提取纯化,再经液-液分离,HPLC 净化。肝和肾在提取前需要增加水解步骤。
9.3.1 称取1g剁碎的组织样于通用瓶中(7.7.3)中。
9.3.2 加2 mL水,匀浆(7.2)。
9.3.3 用质控动物组织(6.4.2.1 - 2)重复步骤9.3.1 - 9.3.4。
9.3.4 加2 mL水于两个试剂瓶中,作为容剂空白。
9.3.5 分别加0.1 mL 3H-玉米赤霉醇液(6.4.1)于试剂瓶步骤(9.3.2,9.3.3)中和两个闪烁瓶(7.8)中,均匀。
9.3.6 对肝和肾样品,加0.1 mL酶(6.2.2)至上述各试剂瓶中,37℃保温2h。
9.3.7 加10 mL乙醚,旋涡混匀30s。在2000 - 3000 rpm(18℃)离心。
9.3.7.1 在干冰/丙酮浴(6.1.1,6.1.2)中冷冻通用瓶,醚相转移至玻璃锥形离心管中(7.7.2)
9.3.8 融化水相,加5 mL乙醚,按9.3.7步骤重复提取。
9.3.9 合并提取液,挥发至干(7.11.1)。
9.3.10 加1 mL氯仿(6.3.1)溶解残渣。
9.3.11 用1 3 mL 1 moL/L NaOH(6.3.2)抽提玉米赤霉醇(旋涡混匀30s,在1000rpm(18℃)离心10 min)。
9.3.12 将NaOH抽提液转移至含有250 L 90% HAc(6.3.3)的试剂瓶(7.7.2)中。
9.3.13 用5 mL乙醚抽取玉米赤酶醇(振荡,离心)。在干冰/丙酮浴中冷冻试剂瓶,醚相转移至玻璃锥形离心管中。
9.3.14 挥发至干(7.11.1)。
9.3.15 HPLC步骤(9.1.10 - 9.1.10.5)
9.3.16 加1 mL明胶-磷酸盐缓冲液(6.5.4),振荡30s。
9.3.17 吸取0.25 mL溶液(9.3.17)至闪烁瓶(7.8)中。
9.3.18 各加10 mL闪烁液至闪烁瓶(9.3.17)中和两个含有回收液的闪烁瓶中(见9.3.5, 9.2.4.1和9.1.2.1)。
9.3.19 各加10 mL闪烁液至两个含有明胶-磷酸盐缓冲液的闪烁瓶(7.8)中,用作背景计数。
9.3.20 用 -闪烁计数仪(7.1)对被测试样(9.3.18和9.3.19)计数20 min。
9.3.21 吸取0.5 mL 样液(9.3.16)至硅化试管(7.7.4)中,进行RIA步骤(见9.5.1 - 9.5.10)
9.4 脂肪。
9.4.1 称取1g剁碎脂肪于通用瓶(7.7.3)中。
9.4.2 加2 mL蒸馏水(6.1.4)。
9.4.3 将质控脂肪(6.4.2.1.2)重复步骤9.4.1 - 9.4.2。
9.4.4 加0.1 mL 3H玉米赤霉醇液(6.4.1)至通用瓶(9.4.2, 9.4.3)中。
9.4.5 各加10 mL 乙醚于试剂瓶(9.4.2和9.4.3)中,振荡1 min.。
9.4.6 在11000g离心10 min。用冷冻仪(7.3.2)在-18℃下将两相分离。
9.4.7 醚相转移至玻璃试管(7.7.2)中。
9.4.8 加5 mL乙醚于所有试剂瓶中,重复提取(9.4.5,9.4.6) 。
9.4.9 合并提取液,挥发至干(7.11.1) 。
9.4.10 加2 mL氯仿(6.3.1)溶解残渣。
9.4.11 按步骤9.3.10起进行。
9.5 放射免疫分析步骤
本法利用活性炭,选择分离结合和游离的抗体。RIA步骤适用于所有组织提取物,包括胆汁、尿液、粪便、肉、肝、肾和脂肪。
9.5.1 吸取0.1 mL甲醇于四个硅化的试管(7.7.4)中,吸取两份0.1 mL玉米赤霉醇标准液(6.5.1)于硅化的试管(7.7.4)中,每管为0-1000 pg间,甲醇挥发至干。例如,在氮气流下(7.11.1)。
9.5.2.1 加0.5 mL明胶-磷酸盐缓冲液(6.5.4)。
9.5.2.2 加0.1 mL 3H-玉米赤霉醇液(6.5.6.2)于样瓶(9.5.2.1)和测试样瓶(9.1.11, 9.2.16, 9.3.20)中。
9.5.2.3 在两个零标准管中加0.1 mL缓冲液(6.5.4),其它试管中各加0.1 mL抗体(6.5.7.1)
9.5.3 旋涡混匀数秒,41oC保温过夜。
9.5.4 4oC下,加入0.5 mL活性炭悬浮液(6.5.3)。
9.5.5 用手缓缓摇动试管。4 oC下静置10 min。
9.5.6 在2000 - 3000 rpm(4oC)离心10 min。
9.5.7 4oC下, 上清液转移至闪烁瓶(7.8)中。
9.5.8 加10 mL闪烁液(6.5.2)于所有瓶中,包括两个含有0.1 mL 3H-玉米赤霉醇液(6.5.6.2)和0.1 mL明胶-磷酸盐缓冲液(6.5.4)瓶中。
9.5.9 闪烁计数前,避光、静止20 min以上。
9.5.10 样品置于闪烁液计数仪(7.1)中计数(预设时间和计数)。例如10000计数或4 min。
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10. 结果计算
10.1 计算方法
绘制校正曲线,纵坐标为3H-玉米赤霉素醇的cpm数(含有标准品为0 - 1000 pg(见6.5.1)的结合抗体),横坐标为标准品的浓度pg。
[注释:两点校正值必须准确,即为回收液放射活性和玉米赤霉醇回收率放射活性]
10.2 cpm校正方程
结合点cpm 3H玉米赤霉醇cpm (T)
校正cpm = ----------------------------------------------------
3H玉米赤霉醇cpm (T) + N (回收率cpm - 背景cpm)
RIA样品的体积
N = --------------------------
回收率测定样品的体积
结合点cpm = 结合测试样的cpm
3H-玉米赤霉醇cpm (T) = cpm,用于RIA培养(见9.5.10),0.1 mL 3H-玉米赤霉醇液(6.5.6.2)
回收率cpm = cpm,0.25 mL测试样提取物(9.3.17)
cpm背景 = 背景cpm,(见9.3.19)
10.3 在校正曲线上读取测试样和溶液空白值。
10.4 计算样品中玉米赤霉醇浓度
1g肉,50 L胆汁和50 L尿液中玉米赤霉醇量(pg)
(曲线pg - 空白pg) (标准回收率 - 空白回收率)
pg = -----------------------------------------------------
N ( (回收率cpm - 背景cpm)
曲线pg = 步骤10.3得到的pg。
空白pg = 步骤10.3得到的溶液空白pg。
标准回收率= 0.1 mL 3H玉米赤霉醇回收率液(6.4.1)的cpm。
回收率cpm = 用于回收率测定(9.2.16.1,9.3.17)测试样提取物体积,cpm。
背景cpm = 背景cpm(9.3.19)。
10.5 替代计算。
B = 结合抗体cpm ---- 用于NSB(NSB管9.5.2.3)的cpm。
B0 = 零标准管中结合抗体cpm -- 用于NSB的cpm。B0应介于总cpm (3H玉米赤霉醇的cpm (T))(见10.2)的40 - 60%。
10.5.1 以B/B0对标准品浓度(pg)作图,得到校正曲线。
10.5.1.1 在有计算机程序条件下,可以绘制log标准品浓度(pg)对Ln Z/(1 - Z)曲线,其中Z = B/B0(LOGIT制图法),可作为插值结果。
10.5.2 用校正的cpm(见10.2)计算测试样和溶液空白的B/B0。从校正曲线中计算玉米赤霉醇的量(pg)。
10.5.3 按10.4步骤操作。
10.5.4 最终结果应包括原始数据。
10.6 精密度: 根据有关判定准则文件(89/610/EEC),用标准品来测定方法的精密度。
11 特殊事例
本法作为光谱法的替代方法
12 方法注意点
当测试出现阳性时,为确保结果的准确性,最好采用性质不同(例如极性不同)的其他色谱柱,再进行HPLC分析作进一步确证。
13. 质量控制、标准品、参考物质和抗体
标明标准品和主要试剂的来源和质量。
13.1 抗体按供应商提供的保存和稀释方法说明进行操作。
13.2 抗体来源
Laboratorie ditormonologie, C.E.R, Rue de Carmel, B-5406, Marloie, 比利时
Genego, Via Ressel S Andrea zona ind., 37470, Rorizia, 意大利
14. 测试报告
列出样品标记、采用的参考方法及结果,列出在测试过程中的独特之处以及会影响测定结果的某些操作步骤。
15. 缩略语(略)
一些重要缩写见第12部分附录1和第5部分(标准)。NSB为非特异性结合。
16. 检测流程图
组织 -------→ 加缓冲液 + 回收率标准 -------→ 均质
液体(尿、胆汁、血浆、血清) ↓
↓
回缓冲液 + 回收率标准化 -------------------→ 水解
↓
结果计算 ←----- RIA ←------ HPLC ←----- 有机溶剂提取