一道黑
第1楼2008/11/26
7. 仪器
7.1 500mL离心管。
7.2 100mL玻璃烧杯。
7.3 孔径为47mm的玻璃微孔过滤器。
7.4 25mL玻璃样品瓶。
7.5 50mL梨形瓶。
7.6 带有聚四氟乙烯螺旋帽的3mL玻璃反应器。
7.7 1mL和10mL的玻璃注射器。
7.8 Ultra-Turrax均质器。
7.9 混合器(旋涡)。
7.10 旋转蒸发器(水浴40℃)。
7.11 自动进样用的小样品瓶。
7.12 2mL玻璃瓶。
7.13 离心机。
7.14 超声波浴。
7.15 200 μL和1000μL可调移液管。
7.16 带有加热装置(40℃)的多孔通氮蒸发器。
7.17 膜微孔过滤器，不锈钢，孔径13mm。
7.18 滤膜，直径13mm和47mm。
7.19 固相萃取装置。
7.19.1 真空歧管Vac-Elut。
7.19.2 C8/500mg净化小柱。
7.19.3 sep-pak硅胶净化小柱。
7.19.4 柱型净化小柱组合装置
7.19.5 净化小柱用50mL洗脱液贮存器
7.20 HPLC-LKB 2150泵
色谱柱：10cm×3mm(内径)chromsep(chrompack)柱是由5μm的Hypersil ODS装柱， 保护柱10mm×2.1mm(内径)是由pellicular(30-40 μm)反相装柱。
流动相的流速0.4mL/min，荧光检测器是Perkin Elmer LS4,其激发波长364nm，发射波长470nm，缝宽10nm，量程范围是4.0单位。
使用电子积分器(spectra physics 4290)记录色谱并积分，用Waters Wisp712进样阀进样25μL。
8. 样品和取样程序
注：注意事项见6.3.1和ISO文件78/2-1982
以下注解选自2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
8.1 样品属性：样品应符合64/433/EEC指令中规定的测定肉和奶中残留物的要求。
8.2 样品量：样品量必须满足检验和复验对样品量的要求。本方法中牛
肉、羊肉等的取样量不得少于30g。
8.3 样品的保存和包装应符合在实验室中能正确识别的要求。
8.4 包装、贮存、运输时必须保持试样的完整性，不能影响检测结果，用于分析伊维菌素的试样必须在-18℃以下贮存和运输。
9. 测定步骤
9.1 取5g精细切碎的样品加入15mL乙腈，放入超声波水浴中超声3min，然后均质
2min，在每分钟5000转下离心5分钟。
9.2 将上清液转移到存有40mL水和0.05mL三乙胺的烧杯中，搅拌混匀。
9.3 依次用5mL乙腈和5mL三乙胺/乙腈混合水溶液(6.2.1)淋洗C8键合柱.
9.4 将提取液转移到已经调好柱头和贮液器的Bond-Elut柱中,在排出提取液后(柱子不能干)，再用5mL乙腈洗脱，洗脱液收集到玻璃样品瓶(7.4)中。
9.5 用乙腈分两次每次2mL,将洗脱液转移到50mL梨形瓶中。
9.6 于40℃水浴中用旋转蒸发器浓缩有机相至干。
9.7 加入1mL甲醇溶解残渣。
9.8 绘制校正曲线
为制作范围为0-5μg/kg的校正曲线, 在9.7这个步骤（9.7）进行标准添加实验。
工作标准液（6.3.4.）μL 甲醇（μL） 伊维菌素浓度μg/kg
0 1000 0
25 975 1
50 950 2
75 925 3
100 900 4
125 875 5
9.9 将500μL试样(9.7)T提取液移入反应瓶中，样品在这一步可以存放在-20℃以下。否则要通过在氮气流下蒸发至干，除掉甲醇。
9.10 加入100 μL混合衍生物(6.2.2)，扭紧瓶盖，轻轻摇匀。将反应瓶放入95℃烘箱中1小时。
9.11 将冷却后的样品加入3-4mL三氯甲烷，然后定量转移至10mL注射器中，再注射到sep-pak硅胶柱(7.19.3)上，样品通过柱体，将提取液收集到50mL梨形瓶中，然后再用9mL三氯甲烷冲洗柱体，将冲洗液收集于同一梨形瓶中。
9.12 于40℃水浴中用旋转蒸发器蒸出三氯甲烷。
9.13 将粘稠残留物用0.5mL甲醇移出，通过0.45μm的微孔过滤器后移入1mL的注射器中，将样品收集于一自动进样用玻璃瓶中（7.11）。
9.14 取25 μL进行液相色谱分析 。
10. 结果计算
10.1 建立峰高对标准物浓度的校正曲线。每次注入样品中伊维菌素的量由测定的峰高来计算。然后这个数据用进样体积和平均回收率%(由添加样品计算)修正以得到浓度(mg/kg)。进样25μL标准液相当于0.25g样品。
伊维菌素的保留时间7分钟左右。
回收率(%)= 检测出的伊维菌素量 ×100
添加的伊维菌素量
样品中伊维菌素浓度(mg/kg)=μg伊维菌素(从校正曲线得到) × 1 × 100 1000 0.05 回收率（%）
对于那些伊维菌素含量超出标准曲线范围的样品，将提取液稀释后进行色谱检测并进行适当的体积修正。
10.2 灵敏度
本方法的测定低限是0.002mg/kg
10.3 质量控制方法
10.3.1 确正
6个空白样品添加相当于2μg或5μg/kg伊维菌素，连续三天内每天进行分析，每批确正实验由下列样品组成：
2个空白。
2个2μg/kg标准添加液添加到空白样品提取液浓缩残渣。
2个5μg/kg标准添加液添加到空白样品提取液浓缩残渣。
6个添加2μg/kg或5μg/kg的样品。
分析样品的回收率应为70-110%，批内和批之间的CV值应当在5-15%。
11.特殊情况
12.方法注意点
13.样品控制
每天每批分析16-20个样品，每批样品应包含9-13个未知样品，另加上样品添加的质量控制样品。空白样品由以前分析的样品得到，保证不含伊维菌素。
14.实验报告
15.缩略语表（略）
16.流程图
组织样品 加入乙腈 均质 C 8柱
计算结果 HPLC Sep-pak硅胶柱 衍生化
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