【分享】水产品质量安全检测样品前处理新技术及其发展趋势

2 固相微萃取

固相微萃取法(So1id phase microextraction，SPME) 是80年代末由加拿大Waterloo大学Pawliszyn和Arhturhe教授提出的一种简便、快捷、无溶剂的样品制备与前处理技术。SPME于1994年开始兴起，并获得美国R—D100创造性技术奖，它所用的纤维和注射用的附件已由Supelco公司商品化[6 ,7]。

SPME主要针对有机物进行分析，根据有机物与溶剂之间“相似者相溶” 的原则，利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用，将组分从试样基质中萃取出来，并逐渐富集，完成试样前处理过程。在进样过程中，利用气相色谱进样器的高温，液相色谱、毛细管电泳的流动相将吸附的组分从固定相中解吸下来，由色谱仪进行分析[8,9]。


SPME的萃取模式可分为三种[10]：直接法，即将石英纤维暴露在样品中，主要用于半挥发性的气体、液体样品萃取；顶空法，将石英纤维放置在样品顶空中，主要用于挥发性固体或废水水样萃取；膜方法，将石英纤维放在经过微波萃取及膜处理过的样品中，主要用于难挥发性复杂样品萃取。

在SPME方法中，被测物质的萃取量取决于它在样品基质和固定涂层中的分配平衡。分配系数越大，萃取率越高，检出的浓度也就越佳。提高萃取率的方法有：（1）依据样品情况，即被测物的挥发性与基体亲和程度选择萃取方式以及固定相组成，根据“相似相溶”原理，对于不同极性的样品选取相应固定相。（2）增加固定涂层厚度不仅可提高被测物质吸附量，而且不同厚度萃取的对象也有所不同，小分子或挥发性物质常采用厚的涂层，大分子或半挥发性化合物采用薄的涂层。（3）加入无机盐，调节溶液的离子强度，降低极性有机物的溶解度。（4）可通过调节溶液的pH值，防止某些待测物质离子化。（5）对于强极性物质，可通过衍生化反应来降低待测物的极性，提高其挥发性，增加其吸附到固定相的能力。影响SPME效率的因素除上述外，进样器的内衬直径、进样位置和进样温度也是很重要的控制因素。

SPME优于固相萃取的特点是质传递快，避免了堵塞，操作步骤简单，只有样品在吸着剂和样品之间的分配作用以及浓缩分析物的脱附作用，同时SPME不需要溶剂。SPME不仅可与GC联用，还能与HPLC相联，从而扩大了SPME技术在分析化学领域的应用范围。

固相微萃取技术虽然在我国近几年刚起步，但由于具有方法简单、无需试剂、提取效果好、变异系数小等诸多优点，已在环境、食品、生化、医学等领域有所应用。目前我国在SPME技术的研究和应用方面已有一些进展。张道宁[11]等运用固相微萃取对水中的12种残留有机氯化合物进行富集；杨红斌[12]用SPME技术和毛细管气相色谱快速分析了水中的氯苯类化合物，整个分析过程为20min，检出限可达0.1-2μg/L。

鉴于食品有干扰成分较多的特点，该技术在食品卫生检验中广泛应用还需要进一步探索。

3快速溶剂萃取

美国戴安公司自1996年推出了快速溶剂萃取仪ASE(Accelerated Solvent Extraction)是对化学分析样品前处理的革命性贡献[13]。

快速溶剂萃取技术是根据溶质在不同溶剂中溶解度不同的原理，利用快速溶剂萃取仪，在较高的温度和压力条件下，选择合适的溶剂，实现高效、快速萃取固体或半固体样品中有机物的方法。

ASE快速溶剂萃取仪由溶剂瓶、泵、气路、加热炉腔、不锈钢萃取池和收集瓶等构成，工作流程如图1所示。自动完成全过程仅需13-17min。选择溶剂控制器可有4个溶剂瓶，每个瓶可装入不同极性的溶剂，可选用不同溶剂先后萃取相同的样品，也可用同一溶剂萃取不同的样品。可同时装入12或24个萃取池连续萃取。ASE200型萃取仪萃取池的体积为1,5,11,22,33ml。ASE300型萃取仪的萃取池体积可选用3466和100ml。ASE的应用涉及环境、食品、制药和聚合物领域[5]。

与索氏提取、超声、微波、超临界和经典的分液漏斗振摇等传统方法相比，ASE有如下突出优点：有机溶剂用量少，10ｇ样品仅需15ml溶剂，减少了废液的处理；快速，完成一次萃取全过程的时间一般仅需15分钟；基体影响小，可进行固体半固体的萃取(样品含水75%以下),对不同基体可用相同的萃取条件；由于萃取过程为垂直静态萃取，在充填样品时预先在底部加入过滤层或吸附介质；方法发展方便，已成熟的用溶剂萃取的方法都可用快速溶剂萃取法作；自动化程度高，可根据需要对同一种样品进行多次萃取，或改变溶剂萃取，所有这些可由用户自己编程，全自动控制；萃取效率高,选择性好；使用方便、安全性好，已被确认为美国EPA标准方法，标准方法编号3545[5]。

ASE可用于底泥等固相物质中酸性、碱性和中性物质的萃取，尤其对水环境中的有机氯和有机磷农药、氯代除草剂、多氯联苯类物质、二恶英、多氯二苯呋喃等的萃取十分有效（表1）。

4 微波萃取

微波萃取[19]（Microwave Extraction（ME）或Microwave Assisted Extraction (MAE)）是1986年匈牙利学者Ganzler等人通过利用微波能萃取土壤、食品、饲料等固体物中的有机物，提出了一种新的少溶剂样品前处理方法。

微波萃取技术(MAE)是对样品进行微波加热，利用极性分子可迅速吸收微波能量的特性来加热一些具有极性的溶剂，达到萃取样品中目标化合物，分离杂质的目的。微波萃取是将样品(固体) 置于用不吸收微波介质制成的密封容器中，利用微波加热来促进萃取，对土壤中的PCB和烟尘中的多环芳烃(PAH)，海洋沉渍物中的酞酸酯均有成功的报道，回收率一般优于索氏提取和超声波萃取法。

微波萃取的设备分两类：一类为微波萃取罐，另一类为连续微波萃取线。使用的微波频率一般有两种：2450MHz和915MHz。最早用于微波萃取的设备是家用微波炉，现在已有商品化的设备问世(如MDS-2000和MES-1000)，它包括微波消解装置和配套的密封聚四氮乙烯消化罐。通过控制罐内压力来控制溶剂温度。由于能实行温度，压力的自动控制，萃取时间可选定为数min至数10min（以保护试样不分解为前提），萃取过程一次完成[20]。

我国上海新科技术应用研究所研制的MK-1型压力自控微波溶样系统，具有定时和压力自控功能，但不能实行温度控制，最多可同时处理9份试样。

溶剂选择在微波萃取中有着非常重要的影响，以下几个方面是必须考虑的：一是溶剂可以接受微波能以进行内部加热，这就要求溶剂有一定的极性；二是溶剂对待分离成分有较强的溶解能力；三是溶剂对萃取成分的后续测定较少干扰。此外溶剂的沸点也是应考虑的因素之一。已见报导用于微波萃取的溶剂有：甲醇、乙醇、正已烷和丙酮等 [19]。

MAE的最佳参数除了萃取溶剂外，还包括了萃取设备、萃取温度及时间的选择。为了获得最大的萃取效率，应预先选择好萃取溶剂、萃取压力和萃取时间。

微波萃取是利用微波能强化溶剂萃取的效率，使固体或半固体试样中的某些有机物成分(或有机污染物)与基体物质有效地分离。与微波消解不同，微波萃取不是要将试样消化分解，而恰恰是要保持分析对象的原本化合物状态。微波萃取整个过程包括样品粉碎、与溶剂混合、微波发射、分离萃取液等步聚。萃取过程一般在特定的密闭容器中进行。由于微波能的作用，体系的温度升高，压力升高，且因微波能是内部均匀加热，热效率离，故而萃取效率大大提高。又因为可实行时间、温度、压力的控制，故可保证萃取过程中有机物不发生分解[21]。

微波萃取是一种非常具有发展潜力的新的萃取技术，通过微波强化，其萃取速度、萃取效率及萃取质量均比常规工艺优秀得多。微波萃取是通过偶极子旋转和离子传导两种方式里外同时加热，与其它现有的萃取技术相比有明显的优势。（1）质量高，可有效地保护食品、药品以及其它物料中的有效成分；（2）产量大；（3）对萃取物料具有较高的选择性；（4）反应或萃取快，省时，可节省50％-90％的时间；（5）溶剂用量小；（6）能耗低；（7）无污染，后处理方便；（8）安全；（9）生产线组成简单，投资不大。

微波萃取的缺点一是需使用极性溶剂；二是萃取后要过滤，这就不易与气相色谱等仪器联机而实现自动化。

几种萃取或提取方法的比较如表2。

表2几种萃取或提取方法的比较


目前微波萃取主要用于环境样品的分析，被处理的样品有土壤、沉积物和水。萃取对象有多环芳烃(PAHs)、酚类、残留农药和一些有机金属化合物(有机锡和甲基汞等)。例如：onuska[22]等曾用微波萃取测定了水中的多氯联苯，回收率在64.7％—85.5％。Lopez-Avila等用微波萃取测定了土壤中的微量有机农药等。最近，何小青等通过微波碱解有机氯的同时萃取富集多氯联苯，消除土壤样品多氯联苯测定中有机氯农药的干扰[23]。

到目前为止，微波萃取法还是一种相当年青的试样预处理方法，但此方法问世不久即受到美国、加拿大、英国、法国等国家有关环保研究部门的高度重视。该方法由于简便、快速、实用、适用面广，且仪器价格比较低廉，可以预见不久将会在环境分析、农业分析、食品分析、药物分析、生化分析等领域得到广泛的应用。如果能在仪器设计上实现突破，微波萃取亦可望象超临界流体萃取(SFE)那样与检测仪器实现在线联机，则该方法将会获得更加强大的生命力。

5 固相萃取

20世纪70年代中期出现的固相萃取技术(Solid Phase Extraction，SPE) 是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附剂的一次性萃取柱，分析物和部分杂质被保留在柱上，使大部分杂质与分析物分离，然后分别用选择性溶剂除去杂质，洗脱出分析物，从而达到分离的目的。

固相萃取法与液／液萃取(简称LLE)及一般柱层析相比，可节省时间和溶剂大约90％，减少杂质的引入，对操作者更安全，重现性好，可避免LLE中乳化现象的产生。SPE是另一种色谱技术应用的形式，根据柱小填料大体可分为吸附型(如硅胶、大孔吸附树脂等)、分配型(C8、C18，苯基柱等)和离子交接型。在选择合适的萃取柱和洗脱液及其他优化条件后，可使萃取、富集、净化一步完成，然后直接进行气相色谱法(简称GC)或高效液相色谱法(简称HPLC)分析。

SPE的基本原理是样品在两相之间的分配，即在固相(吸附剂)和液相(溶剂)之间的分配，其保留或洗脱的机制取决于被分析物与吸附剂表面的活性基团，以及被分析物与液相之间的分子间作用力。

固相萃取装置[24]最普通的形式是SPE柱(Catridge)。固相萃取的操作步骤主要包括柱的预处理(活化)、加样、柱的洗涤、柱的干燥、分析物的洗脱五个步骤。目前商品SPE柱或片有一次性使用和多次使用两种，一次性SPE柱一般不能反复使用。固相萃取技术的分离模式[25]主要有正相吸附、反相吸附和离子交换等模式。

目前的自动化仪器可分为半自动和全自动两种，半自动SPE是指萃取过程机械化，但将洗脱液转移到进样阀则需手工操作；而全自动SPE则是真正的在线操作，整个的萃取和分析过程都由机器控制完成。

现在，可更换柱的商品化仪器也有出现，如荷兰Spark公司的“Prospect”及Merck公司的“OSP—2”系统[26]。

SPE 既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取、又可用于净化、浓缩或富集，是目前兽药(渔药)残留分析样品前处理中的主流技术。赵文亚等 [27]气相色谱法测定水产品中氯霉素残留。样品中的氯霉素用乙酸乙酯提取，正己烷去脂肪，过Sep-C18柱进行净化。该方法的检测背景干扰少，精密度和准确度高，低浓度下回收率好。另外，目前水产品中土霉素、己烯雌酚残留检测样品前处理中均使用SPE小柱。

6 超临界萃取

发展了30多年的超临界萃取(Supercritical Fluid Extraction， SFE)技术是利用超临界流体在临界点附近所具有的特殊性而达到分离的目的。尤其适用于分离低挥发度、热敏性物质。与蒸馏和液体萃取相比具有能耗低、萃取速度快、萃取质量优等特点，引起国内外科学家的极大兴趣。从目前情况看，SFE作为一种新的分离技术已经为人们所公认。SFE在高附加值、热敏性、难分离物质的回收和微量杂质的脱除有其优越性。因具有简单、快速、对环境“友好”及有较好的选择性而具有较大的应用价值。

超临界流体是物质处于其临界点(Tc、Pc) 以上状态时所呈现的一种高压、高密度流体。物质处于超临界状态时，密度接近液体，粘度只是液体的1/100，扩散系数介于气液之间。超临界流体的这些特性，使其具有比液体分子大得多的能量和作用力，故可作萃取溶剂。超临界流体对溶质的溶解度取决于其密度，密度越高溶解度越大。当改变压力或温度时，密度即发生变化，导致溶解度变化。在高压下，从原料中萃取溶质，升高温度或降低压力，又使溶质和溶剂分离，从而达到萃取分离目的[28]。

SFE特点：（1）萃取分离通常在较低温度下进行(如CO2，Tc=31℃，萃取可在略高于室温条件下进行)，特别适用于分离难挥发热敏性物质。（2）超临界流体具有极高的扩散系数和相当低的粘度，因此具有良好的传递性能和较强的渗透能力(对固体特别有用)，有利于进行快速萃取和分离。（3）超临界流体具有良好的选择性，密度可在相当宽的范围内随压力和温度的改变而改变。操作方便、过程调整灵活。（4）节省能源。溶剂和溶质的分离只是通过改变温度和压力来达到，溶剂没有相变化存在，因此只涉及显热;萃取温度比液体萃取温度高，使溶剂在循环过程中温差小，易于实现热量回收，故较其它分离方法可较大幅度节省能源。（5）萃取质量优。选用合适的萃取剂，可以制得高纯度产品。在一些天然物质的萃取中，还可较传统萃取法更有效地保留易挥发的有效成分，保持其“天然”本色。

1986年Capriel[29]等开始将SFE技术应用于农药残留分析。20世纪90年代,众多研究者分别就植物样品、动物组织、果实、土壤、水等样品中多种杀虫剂、杀菌剂和除草剂进行萃取,得到了较为理想的结果。Seidel[30]等研究认为可以将SFE萃取法列为分析的首要方法。

任何环境样品，均可采用SFE技术进行处理，对固体样品尤其合适，其代表性的应用，如表3。

表3 SFE在样品预处理中的应用




超临界萃取技术是一种新型的分离技术，萃取机理以及过程控制因素等方面的认识有待进一步深化和完善。我们认为在研究中应在以下两方面开展更加深入的研究工作：(l)长期以来，对超临界萃取的产业化，主要是单纯超临界CO2的间隙、半间隙式萃取。单纯超临界CO2流体相当于一种弱酸性的非极性的亲脂类溶剂，在使用上具有极大的局限性，制约了产业化的发展。应该开发超临界多元流体的分步选择性萃取、重组萃取及精馏萃取新工艺，使其可以应用于强极性大分子、极性水溶性、非极性脂溶性的有效成分的提取。(2)对于精确可靠的模拟、设计技术的需求以及热力学数据的进一步充实[31]。

7 凝胶渗透系统

凝胶渗透色谱技术(Gel Permeation Chromatography，GPC)是根据溶质(被分离物质)分子量的不同，通过具有分子筛性质的固定相(凝胶)，使物质达到分离.凝胶渗透色谱法最初主要用来分离蛋白质，但随着适用于非水溶剂分离的凝胶类型的增加，凝胶渗透技术应用于农药残留量净化得以发展。1967年Ruzicka等首先采用SephadexLH-20分离净化蔬菜中的有机磷农药。1971年Stalling等将凝胶渗透色谱作为一种快速净化技术，应用于农药残留分析中脂类提取物与农药的分离，并使该技术初步自动化。随后，凝胶净化技术受到广泛重视，成为农药残留分析中的一种主要净化手段，并不断得到改进和发展[32]。

GPC是分子排阻机理进行分离的色谱技术, 是利用固定相孔径的不同，把被分离的组分按分子大小分离的一种方法。但根据所用的凝胶(固相)的性质和流动相的组成，有时兼有分配、吸附等作用。一般来讲，当采用较小孔径的凝胶和较强极性的流动相(如四氢呋喃)时，则以排阻作用过程为主。在芳烃的监测中，GPC是除去类脂物较好的途径。GPC也可以用来进行族分离，如从非共轭的母体分离较强极性物和从芳香卤烃分离脂肪族卤烃等[33]。

GPC的最佳参数不仅包括溶剂、载体的选择，还包括合适的温度以及溶质的化学性质等。

GPC是一种快速的净化技术，是多农药残留分析中一种常用有效的提纯方法，应用于农药残留分析中脂类提取物与农药的分离，是含脂类食物样品农药残留分析的主要净化手段。GPC不仅可用来分离和测定小分子物质，而且还可以分析具有相同化学性质但分子体积不同的高分子同系物。

GPC由于具有自动化程度高、较好的净化效率、以及较好的回收率，被广泛用于纯化含类酯的复杂基体组分。Balinova[34]采用GPC提纯步骤，用HPLC检测了5种GC无法检测的农药(杀虫隆、氟虫服、四蜗嗓、唾蜗酮、除虫服)，方法灵敏度高、准确度及精密度好、数据线性范围宽(2—40 ng)，能够很好地分离共萃取基质。Specht[35]采用Lukc法和GPC相结合的多农药残留分析方法，在食品和水果的农药分析中研究了和微硅胶柱色谱法不同的许多条件。Nunes[36] 用GPC提取净化了药用植物中的有机磷、有机氯及拟除虫菊酯类农药，其中有机氯、拟除虫菊酯类农药还需用硅胶柱进一步的净化，净化后的样品分别用GC—ECD、GC—NPD检测，所有待测组分的回收率都大于86％。

挪威国家与海产品研究所实验室在进行海产品中抗寄生虫药物吡喹酮和农药氯氰菊酯、溴氰菊酯及敌敌畏检测中样品经提取后用GPC净化。

与吸附柱色谱等净化技术相比，凝胶净化技术净化容量较大，可重复使用，适用范围广，使用自动化装置后净化时间缩短、简便、准确。随着凝胶品种的增多和高效凝胶的出现，凝胶净化技术会受到越来越多的重视，并将成为食物中农药残留分析的常规净化手段。