【资料】杀菌剂多残留分析方法（扫盲篇）

realtiger

2009/01/12

私聊

农残检测

杀菌剂多残留分析方法

检测农产品中农药残留量是评价其是否超过MRL值的前提，因此农药残留分析方法得到各国的重视。无论是多残留分析(MRMs)还是单残留分析(SRMs)，均基于相似的检测步骤，多残留分析由于可同时检测多种农药残留的存在，因此通常是首选方法。公职分析化学家协会(AOAC)的方法是国际公认的多残留分析方法，可用于多种农药残留的检测。该方法通常用水溶性的溶剂提取，紧接着的净化用不溶于水的溶剂进行分配，再用硅胶或弗罗里硅土净化，净化后的提取物用气相色谱、高效液相色谱检测。尽管AOAC方法可以检测多达325种农药及相关化合物，但也存在一些不足之处，如效率低，不适于进行筛选分析；有些试剂有毒且用量大；不能分析一些新农药等。
针对上述缺陷，一些新的提取、净化方法得到重视和发展，如固相萃取(solid-phase extraction，SPE)、固相净化(solid-phase cleanup，SPC)、基质固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)、超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)等。这些技术的突出特点是简便、样量小型化、萃取的广泛性。检测技术上，气相色谱及高效液相色谱仍然是主要的技术手段。气相色谱方面，采用微波诱导等离子(microwave induced plasma，MIP)-原子发射检测器(atomic emission detector，AED)及多级质谱的检测技术取得了快速的发展；离子及离子对色谱以及柱后衍生技术的应用是高效液相色谱检测的研究热点，激光诱导荧光检测器也已开始应用。超临界流体色谱(Supercritical fluid chromatography, SFC)在农药残留检测中的成功应用，实现了样品中农药残留的提取、净化、检测一步完成，是当前联用技术的典型代表。
2.1 提取
从样品中提取残留农药的效果，很大程度上决定于农药的极性及样品基质的类型。提取过程通常将样品置于匀浆瓶中，添加溶剂，利用匀浆器(homogeniser)、搅拌机(blender)或超声波发生器(sonicator)匀浆。常用的有机溶剂有丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙脂等，根据样品类型、含水量及目标农药，有时需要添加适量的水或调整pH值。
多数情况下样品能均匀的分散在有机溶剂中，从而可提高被测残留物的回收率，减少共提的干扰物比率。经均化作用后，以过滤或离心的方法将溶剂和固体分开。
2.1.1乙腈提取法
乙腈提取法可应用于大多数农药和其它一些化合物的提取，然而在该方法中，许多水溶性(极性)化合物在石油醚从乙腈水中提取农药以及在弗罗里硅土柱层析或氧化镁/硅藻土柱进行层析净化时，水溶性化合物或部分或全部损失。尽管如此这种提取方法仍适用于许多杀菌剂的分析。在Liao等人的方法中采用乙腈进行提取，通过添加氯化钠使乙腈与水分离，上层部分(乙腈)浓缩至小体积后用气质联用仪检测。AOAC早期的方法及美国加州食品和农业部 (California Department of Food and Agriculture，CDFA)的MRSM (Multiresidue Screen Method) 方法多采用乙腈作为溶剂。
2.1.2丙酮提取法
由于丙酮具有无毒、易于纯化、与乙腈和其它一些溶剂相比挥发性好而且价格低廉等优点，因此也是一种常用的提取溶剂，许多方法采用它。此外，在样品中含糖时，丙酮不会象乙腈那样与水形成两相，故可用于高含糖量的样品。实验表明，丙酮具有广泛的化合物和样品基质适用性，已有的回收率数据包括400余种化合物，其中含杀菌剂40余种。
理论上，丙酮可用于提取任何样品中除了带有永久离子之外的残留农药。因此，许多国家农药残留标准方法均采用丙酮作为主要溶剂，如德国的DFG S19方法，美国FDA MRMs方法等。在这些方法中，丙酮提取液用氯化钠或硫酸钠饱和之后，分配至二氯甲烷、己烷或石油醚中，从而可得到对不同化合物有利的分配特性和有机相的快速分离。
2.1.3乙酸乙酯提取法
乙酸乙酯极性相对丙酮、乙腈要弱，因此其对弱极性农药的提取回收率一般较好些，并且其共提物尤其是色素要显著少于丙酮，从而减少了净化时的压力。采用乙酸乙酯作提取溶剂的方法最早由Ross等提出，提取液采用凝胶渗透层析(GPC)净化(SX-3柱)，杀菌剂的回收率超过90%。1989年，瑞典国家食品管理局将其列为国家多残留分析方法，替代了原来由Anderson和Ohlin建议的方法。现在该方法已能检测约160种农药、异构体及降解代谢产物。在荷兰的国家方法中，乙酸乙酯也作为主要的提取溶剂。由于省去净化步骤，乙酸乙酯提取方法也被称为在线提取法(on-line extraction methods)，其理论基础是Gibbs三角，可用于在线提取的有机溶剂对还有正己烷/丙酮(8∶2)、乙酸乙酯/二甲苯、丙酮或乙腈/二氯甲烷或石油醚等。
2.1.4其它提取方法
固相萃取是近年发展较快的一种提取、净化方法，作为一种提取技术，主要应用于液体样品中农药的提取，用于农产品及土壤等固体或半固体样品中农药的提取，实质上是一种净化、富集过程。商品化的固相萃取装置很多，主要是固相萃取小柱、固相萃取盘等，其发展主要体现在填料方面，如石墨化炭黑、键合硅胶、弗罗里硅土、活性炭、硅胶等。
基质固相分散萃取是类似于固相萃取的一种提取、净化、富集技术，其是将吸附剂或填料与样品一起研磨分散，然后装柱，用有机溶剂淋洗，使农药淋洗出来，淋洗液一般无需进一步净化，可直接进气相色谱或高效液相色谱检测。MSPD实际上将包括样品匀浆、细胞裂解、完全提取、分馏及纯化过程集于一个简单的过程。有些淋出杂质较多的样品，也可进行净化、分析。Kadenski等采用MSPD技术，研究了多种农药在一些蔬菜、水果中的回收。与传统方法相比，MSPD具有显著的优点，主要表现在，缩短了样品分析周期；减少了样品量，从而极大的降低了溶剂的用量，降低了环境污染的可能性并提高了操作安全性；适用于自动化操作等。

相关话题

+关注

私聊

realtiger

第1楼2009/01/12

上世纪80年代末，超临界流体萃取仪的商品化取得了突破，90年代，SFE在各种领域的应用得到了突飞猛进的发展。在农药残留分析领域，SFE也得到广泛的应用，其突出的优点在于节省人力、操作费用低、提取中基本无废弃物产生，不用或少用溶剂等。然而，对一些热稳定性差不适于用气相色谱检测的化合物，以及含有胺基、氨基、酰亚胺等结构易离解的化合物，却不适于用SFE 提取。Aharonson等提出了一种SFE方法，可用于提取苹果、香蕉和马铃薯中的苯并咪唑类杀菌剂涕必灵、多菌灵、甲基硫菌灵残留。
2.2净化
在大部分提取方法中，最初的提取液、由于含有太多的共提干扰物质而无法直接分析，所以要用某些净化步骤。最常用的净化方法有液-液萃取法；以氧化铝、硅胶、弗罗里硅土、活性炭和硅藻土等作填料的柱层析法；固相萃取法；固相分配法(大孔硅藻土材料)；筛析色谱法（如凝胶渗透色谱法）和扫集共蒸馏法等。实际上，开发的一些新的提取方法已包含净化过程，如前面所述的SPE、MSPD、SFE等，因此不再贅述。
2.3分离和检测
填充柱或毛细管柱气相色谱法仍是农残分析中最常用的分离技术，而最常用的检测器是电子捕获检测器(ECD)，火焰光度检测器(FPD)和热离子检测器(NPD)，也采用其它一些检测器，如原子发射检测器(AED)和电解电导检测器(ELCD)。高效液相色谱法主要用于热不稳定化合物的分离，常用的检测器有紫外检测器，荧光检测器和二极管阵列检测器。
采用紫外光或喷雾显色进行检测的薄层色谱法(TLC)仍具有重要的应用价值，而胆碱酯酶抑制作用是灵敏的目测和测定体系的基础，薄层扫描仪的应用及自动点样与多级展开系统的开发，更使HPTLC检测的灵敏度及检测范围得到极大的提高与扩大。
2.4 确证
如同其它所有的痕量分析一样，对全部结果进行确证是残留分析的基本要求，确证残留物最常用的系统是：采用另一根不同的气相色谱柱并选用另一种检测器；采用与中等分辨率质谱仪联用的气相色谱仪；采用带不同接口的液质联用仪等。
一些常用杀菌剂的多残留分析方法见表4。
表4 常用杀菌剂多残留分析方法
样品类型提取方法(e) 分配方法(p) 净化柱(c) 洗脱液(e) 检测限 (mg/kg) 杀菌剂备注
常见作物 e：乙腈 p：石油醚 c：弗罗里硅土或氧化镁 e：乙醚/石油 /
大多数低极性/非极性杀菌剂 GC-ECD、NPD
非脂肪性13种作物 e：乙腈 p：乙腈/饱和氯化钠水溶液不需净化 0.05～0.10
双苯三唑醇、百菌清、多克菌、氯硝胺、乙环唑、恶霜菌丹、异菌脲、甲霜灵、氟苯嘧啶醇、甲呋酰胺、甲苯氟磺胺、乙烯菌核利和大多数低极性/非极性杀菌剂
GC-MS
非脂肪性食品 c：丙酮 p：二氯甲烷/石油醚通常不需净化，若有必要则用弗罗里硅土柱进行净化
0.05
敌菌灵、多克菌、百菌清、苯氟磺胺、氯硝胺、恶霜菌丹、异菌脲、抑霉唑、腐霉利、五氯硝基苯、三唑醇、三唑酮、乙烯菌核利和大多数低极性/非极性杀菌剂。
GC-ECD、NPD，对于恶霜菌丹、多克菌和敌菌丹也可用HPLC
非脂肪性食品 e：丙酮或丙酮/水 p：二氯甲烷吸附色谱 c：混合吸附剂，氧化铝和硅胶
e：二氯甲烷，己烷/乙醚，己烷+苯+乙酸乙酯 0.01～0.1
多克菌、百菌清、氯硝胺、三唑酮、乙烯菌核利、恶霜菌丹、氟苯嘧啶醇、萎锈灵、灭螨猛、氯苯嘧啶醇和大多数低极性/非极性杀菌剂。
GC-ECD、NPD，HPLC
一般 e：丙酮 p：二氯甲烷 SEC系统(GPC) C：Bio Beads SX3
E：乙酸乙酯/己烷 0.001～0.05 大多数低极性/非极性杀菌剂。
GC-ECD、NPD，HPLC
水果和蔬菜 e：丙酮固相分配 c：Extrelut 20(Merk) e：二氯甲烷 /
敌菌丹、多克菌、苯氟磺胺、氯硝胺、己唑醇、三唑酮、乙烯菌核利。 GC-ECD
水果和蔬菜 e：丙酮固相分配 c：C18小柱 e：甲醇 /
氯硝胺、百菌清、乙烯菌核利、三唑酮、敌菌灵、多克菌、恶霜菌丹、腐霉利、敌菌丹、异菌脲、邻苯基苯酚、联苯。
GC-ECD，HPLC-UV、FD
一般食品 e：乙酸乙酯 SFE系统(GPC) c：Bid-Beads SX3 e：乙酸乙酯/环己烷
0.02～2 双苯三唑醇、敌菌丹、百菌清、苯氟磺胺、异菌脲、三唑醇和大多数低极性/非极性杀菌剂
GC-ECD、NPD
3. 特定的分析方法
有些杀菌剂无法用多残留方法检测，因此对于这些杀菌剂有一些特定的分析方法，对于二硫代氨基甲酸盐可用高效液相色谱法直接检测，或者将其转化成二硫代碳后，用分光光度法检测。乙撑硫脲(ETU)和亚丙烯脲(PTU)是二硫代氨基甲酸盐最重要的代谢物，对于它们的检测，文献提出了不同的方法，有些用固相萃取，有些在溶剂提取后进行衍生化，可利用的仪器技术有高效液相色谱法和气相色谱法。
苯并咪唑类化合物是一类重要的杀菌剂，可用于田间或采用植物病害的防治。其残留分析代表性的提取溶剂有乙酸乙酯、丙酮/二氯甲烷/石油醚(1∶1∶1，V/V/V)、甲醇/0.02M HCl(80∶20，V/V）以及超临界流体萃取(SFE)。
净化方法除了常用的酸-碱液液分配外，SFE可用于净化，(但其要求昂贵的设备，为了获得理想的回收率，萃取条件、改性剂、样品中含水量与固形物的比例等都要进行选择)，排阻色谱也可用于净化，但其对淋洗剂要求较严格。

（摘自岳永德）