【转帖】常见致病微生物的检测

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三、说明

（一）样品的处理和稀释：

　　1．操作方法：以无菌操作取检样25g（或25ml)，放于225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1：10的均匀稀释液。

　　固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。

　　用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液。

　　另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管。

　　2．无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。

　　操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

　　3．采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

　　4．样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。

　　在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。

　　为减少稀释误差，SN标准采用取10mL稀释液，注入90mL缓冲液中。

　　5．稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。

（二）倾注培养

　　1．操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

　　将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

　　待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

　　2．倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。

　　倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。

　　3．为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。。

　　4．培养温度一般为37℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30℃）。培养时间一般为48h，有些方法只要求24h的培养即可计数。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。

　　5．为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。

　　在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。

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（三）计数和报告

　　1．操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。

　　2．到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

　　3．计数时应选取菌落数在30~300之间的平板（SN标准要求为25~250个菌落），若有二个稀释度均在30~300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。

　　4．若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。

　　5．不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。

　　6．当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

　　7．当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

　　8．菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。

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大肠菌群及检验
一、大肠菌群介绍

　　大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

　　大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。

　　大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。

　　大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。

二、大肠菌群检验方法：
　　由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

　　目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
　　乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

　　分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。

　　证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。

　　报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

　　具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》

（二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：
　　推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。

　　证实试验：将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。

　　具体操作参见 SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》

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三、说明：
1．MPN检索表：
　　MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。

　　MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。

2．初发酵和证实试验：
　　无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

　　初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。

3．产气量与倒管：
　　在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。

4．挑选菌落：
　　国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。

　　另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。

5．抑菌剂：
　　大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。

　　国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。

　　抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行。

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耐热大肠菌群及检验
一、耐热大肠菌群的定义
1、耐热大肠菌群　
　　耐热大肠菌群在不同的检验方法中有不同的定义（如下表所示），它指的是具有某些特性的一群细菌，而非生物学分类概念。

来源
定义
适用的食品
制订机构

NMKL No125 3nd ed 1996
耐热大肠菌群是指在紫红胆盐琼脂上于44℃培养24h后形成直径至少为0.5mm、绕有有一红色沉淀环的深红色菌落的细菌，如有需要可在含有乳糖的液体培养基中44℃产气证实
除生鱼和渔产品以外的所有食品
北欧食品分析委员会（NMKL）

NMKL No96 2nd ed 1994
在EC肉汤于44.5±0.2℃培养，24h内产气的细菌
新鲜和冷冻的海产食品
北欧食品分析委员会

ISO 9308-2：1990（E）
能在液体乳糖培养基中35±0.5℃或37±0.5℃培养，48h内能产酸产气，并在44±0.25℃或44.5±0.25℃培养24h内产酸产气的细菌
水

（MPN法）
ISO

ISO9308-2：1990（E）
能在液体乳糖培养基中35±0.5℃或37±0.5℃培养，48h内能产酸产气，并在44±0.25℃或44.5±0.25℃培养24h内产酸产气的细菌
水

（膜过滤法）
ISO





2、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较
　　北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。


项目
依据
定义

耐热大肠菌群
NMKL、ISO
在44.5℃培养，24h天内能产酸产气的细菌

粪大肠菌群
NMKL
在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群

AOAC
于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌

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3、耐热大肠菌群的卫生学意义
　　作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。

　　作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。

　　通常情况下，耐热大肠菌与大肠菌群相比，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且由于在自然界容易死亡等原因，耐热大肠菌群的存在可认为食品直接或间接的受到了比较近期的粪便污染。因而，耐热大肠菌群在食品中的检出，与大肠菌群相比，说明食品受到了更为不清洁的加工，肠道致病菌和食物中毒菌的可能性更大。

　　耐热大肠菌群比大肠菌群能更贴切地反应食品受人和动物粪便污染的程度，且检测方法比大肠杆菌简单地多，而受到重视。

二、耐热大肠菌的检测方法

　　国际目前耐热大肠菌群的检验方法主要有四种，NMKL有两个，分别针对不同产品，ISO有两个，仅适用于水的检验。下面以出口水产品中耐热大肠菌群的检验方法（根据NMKL、N96、1994方法整理）为例进行介绍。

1．定义：见上表。

2．适用范围：新鲜和冷冻水产品，包括鱼、鱼制品、贻贝、贻贝制品、贝类及贝类制品。

3.培养基和试剂：

1）生理盐水

氯化钠 8.5克

蒸馏水 1000mL

分装10mL管后，121℃灭菌15min。

2）月桂基硫酸盐肉汤

胰多胨 20克

乳糖 5克

氯化钠 5克

磷酸氢二钾 2.75克

磷酸二氢钾 2.75克

月桂基硫酸盐 0.1克

蒸馏水 1000mL

分装每管10mL，内加童汉氏管，121℃灭菌15min，灭菌后pH为6.8±0.2。

3）EC肉汤

胰多胨 20克

乳糖 5克

氯化钠 5克

磷酸氢二钾 4克

磷酸二氢钾 1.5克

蒸馏水 1000mL

分装每管10mL，内加童汉氏管，121℃灭菌15min，灭菌后pH为6.8±0.2。

4.操作步骤：

4.1样品处理：取不同部位渔产品剪碎，称取25克于225mL灭菌生理盐水中，充分摇匀。取上清夜1mL用灭菌生理盐水做梯度稀释。其它样品依此方法稀释。

4.2推测实验：取3个连续浓度的稀释液1mL接种内盛10mL灭菌月桂基硫酸盐肉汤的试管，于37±1℃培养两天，观察童汉氏管内是否有气泡产生。

4.3确证实验：将4.2中产气的试管接种至EC肉汤中，于44.5±0.2℃培养，24h天内产气的判为阳性。

4.4结果：根据4.3中的阳性管数，查MPN表（参见SN0169-92附录）确定每克原始样品中的耐热大肠菌群数。

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埃希氏大肠菌及检验


一、定义：

　　大肠埃希氏菌更习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。与人类疾病有关的大肠杆菌，统称为致泻性大肠杆菌（此名称不易与致病性大肠杆菌相混淆），一般包括五种：即肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）和粘附性大肠杆菌（EAEC）。文献报道还有几种，象：凝集性大肠杆菌、即产VT毒素又具有侵袭性的大肠杆菌等，但目前尚未达成统一共识。

二、生物学特性：

基本形态特征：

　　此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般大小约0.5μ-0.8μm*1.0μm-3.0μm,因生长条件不同，个别菌体可呈近似球状或长丝状。此菌多单独存在或成双，但不呈长链状排列。约有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能运动，但多数菌体只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱；多数菌株生长有比鞭毛细、短、直且数量多的菌毛，有的菌株具有荚膜或微荚膜；不形成芽胞，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。

培养特征：

　　由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：（1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。（2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。（3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。此菌兼性厌氧，在有氧条件下生长良好，最适生长pH为6.8-8.0，所用培养基pH为7.0-7.5,若pH值低于6.0或高于8.0则生长缓慢。

生化反应与血清学反应

　　大肠杆菌属于卫生学意义的大肠菌群和粪大肠菌群的范畴，因此，必须符合大肠菌群和粪大肠菌群的有关定义，在检测大肠菌群、粪大肠菌群的基础上，可以应用I（吲哚）、M（甲基红）、Vi（3羟基-2-丁酮）、C（柠檬酸）即IMViC生化试验对大肠杆菌作进一步鉴定，其IMViC结果为++--或-+--。生化反应是鉴定大肠杆菌的主要方法之一，然而，大肠杆菌之间生化反应的差异非常常见，象：许多菌种非/迟发酵乳糖，但并不说明它们遗传上有明显不同，生化反应非典型的大肠杆菌菌株与典型菌株的DNA相关性在85%-100%。附表1为大肠杆菌生化反应特性表。其中H2S、脲酶、阿糖酸、吲哚、ONPG试验常为首选生化反应，其余为进一步的生化试验。大肠杆菌在赖氨酸脱羧酶、粘质酸盐、醋酸盐生化试验中，有一项或多项试验阳性，且厌氧性生长弱，有动力和吲哚试验阳性可与志贺氏菌相鉴别。

　　大肠杆菌的血清学反应，往往是对经分离、鉴定、确证为大肠杆菌的 进一步分型，常不作为常规方法使用。附表2所列主要致泻性大肠杆菌的血清型。对大肠杆菌的分型鉴定工作，基层检验单位若有要求时，可与各地所属出入境检验检疫局实验室联系，委托进行血清学鉴定工作。

三、大肠杆菌的抵抗力：

　　此菌对理化因素的抵抗力，在无芽胞菌中是最强的一种，在室温可存活数周，在土壤、水中存活数月，耐寒力强，但是在30分钟内快速冷冻，将37℃降至4℃的过程，可杀死此菌。加热60℃，30分钟，此菌可灭活。对漂白粉，酚、甲醛等较敏感，水中1ppb氯可杀死此菌。此菌耐胆盐，在一定程度上能抵抗煌绿等染料的抑菌作用，在选择性培养基配制上，常利用此菌这一性质。

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四、卫生学意义与流行学

　　由于大肠杆菌是人及各种动物肠道中的正常寄居菌，常随粪便从人及动物体排出，广泛散播于自然界，所以一旦检出大肠杆菌，即意味着直接或间接地被粪便污染，而在卫生学上被用于饮水，牛奶或食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；并且由于大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近，它的出现也可能预示着某些肠道病原菌（例：沙门氏菌、志贺氏菌）的存在，因此该细菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。

　　致泻性大肠杆菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病，其中尤以EPEC、ETEC所占比例为大。附表3是我国部分省市主要腹泻病原体检出率情况，尽管目前报道各地主要腹泻病是由志贺氏菌或轮状病毒引起的，但是，多年来，致泻性大肠杆菌引起的腹泻病例始终位于第二位，可见大肠杆菌肠道传染的广泛性。还有，致泻性大肠杆菌亦可常年引发人体腹泻，以夏秋季为高峰，在患者感染住院率中，婴幼儿占60%以上。近来，EHEC O157：H7为世界卫生组织（WHO）定为新的食源性致病菌，其引发的出血性肠炎的暴发或散发病例，自1983年以来在北美州（美国、加拿大）地区逐年增多，英国、日本亦有爆发和散发病例报道，我国也发现散发病例，尚未有爆发EHEC的报道。附表4为近几年EHEC的污染状况。


五、大肠杆菌检验程序图解：

检 样

↓

LST肉汤

↓37℃，48h


LST肉汤管阳性 （疑似大肠菌群）

↓37℃，48h　　　　　　　｜　　

EC肉汤　　　　　　　 BGLB肉汤管阳性 （证实大肠菌群）


↓44℃，24h　 　按BGLB肉汤产气管数，查MPN表，报告大肠菌群MPN/g
EC肉汤产气管为阳性（粪大肠菌群）


查MPN表，报告粪大肠菌群MPN/g


阳性管再培养24h

EMB平板分离

↓ 37℃，24h



--------------------------------------------------------------------------------

黑色菌落移种营养琼脂斜面


LST肉汤 　　　IMViC生化试验　　　　 革兰氏染色


产酸产气　　　 ++--/-+-- 　　　　　无芽胞G-杆菌

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－







大肠杆菌

按EC肉汤产气管数，查MPN表，报告大肠杆菌MPN/g


说明：

1、由于大部分致泻性大肠杆菌在6℃条件中可失去活力，故大肠杆菌的定性检测比定量检测更适宜。如果确有大肠杆菌定量检测要求的话，可用MPN法或终点稀释法进行。

2、基层单位如有大肠杆菌生化鉴定要求或大肠杆菌血清学分型要求，可委托属地出入境检验检疫局进行检验。

3、检测大肠杆菌的MUG法和膜过滤法，可参阅有关标准说明进行。

4、国标法与FDA方法，在所用培养基、检验程序上略有差异，但不影响大肠杆菌检验结果的准确性。本章介绍的方法，可详见SN 0169-92标准。


　

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出血性大肠菌及检验

一、概况

　　肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以O157:H7血清型为代表菌株。

　　肠出血性大肠杆菌感染可引起轻度腹泻、出血性结肠炎（HC）、溶血性尿毒综合症（HUS），血栓性血小板减少性紫癜（TTP）等。其中HUS病程凶险，易造成急性肾衰竭乃至死亡。

　　1982年美国首次报道了由EHEC O157:H7引起的出血性肠炎暴发。此后，世界各地陆续报道了该菌引起的感染，并有上升趋势。1996年在日本发生的EHEC O157:H7的暴发流行，引起出血性腹泻，先后波及30多个都、府、县，感染近万人，并造成12人死亡，引起了全世界的关注。此外，美国、加拿大、瑞典、澳大利亚、英国的苏格兰和威尔士等国家和地区也相继报道了EHEC的散发性感染和暴发流行。日本、加拿大及瑞士等国已将EHEC O157:H7列为必须报告的传染病，予以高度重视。我国于1988年首次分离到EHEC O157:H7，从已有的流行病调查资料来看，我国亦存在EHEC的散发病例，但尚未有暴发流行的报道。

二、流行病学

　　EHEC O157:H7引起的感染有明显的季节性，多发生于夏秋两季，7-8月为发病高峰。在地区分布上，多发生于发达国家，主要以散发性感染为主。在年龄分布上，儿童与老年人的发病率明显高于其他年龄组，且并发HUS和TTP的机率较高。最易分离到 O157:H7的年龄为5-9岁（0.9%）和50-59岁（0.89%）。农场动物，尤其是反刍动物，构成EHEC O157:H7在世界范围内的主要贮存宿主。O157:H7在牛中的流行报告范围为0.1-16%；羊、猪、鸡、马、鹿、鸽子、海鸥等动物均可能为EHEC的携带者。EHEC的感染可形成直接传播（动物→人，人→人），也可以通过间接传播（食物、水源→人）。食源性的EHEC感染中，牛肉、生奶、鸡肉及其制品，蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染。其中， 牛肉是最主要的传播载体。

　　EHEC O157:H7的感染剂量极低。潜伏期为3-10天，病程2-9天。通常是突然发生剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，可发热或不发热。部分患者可发展为HUS、TTP等， 严重者可导致死亡。