【原创】『博主翻译』HPLC柱十大误区[上] [下]

误区三：保护柱不影响分离效果
否首先，配一个保护柱很好。如果固定相选择错误，保护柱也能够对分离有效果。要明确的是：保护柱是保护分析柱避免被高残留的组分污染用的，尤其是那些不想进让它柱子的部分。保护柱比起分析柱便宜许多，所以污染的保护柱能够替换的更加勤。

理想的结果是，保护柱的固定相和分析柱恰好相同。如果固定相保留强（如高载碳量和混合相），就能够使得保留便宜而影响分离，甚至导致不同的选择性。如果保留弱，问题就不那么明显，除非固定相影响整个体系选择性。

为了使保护柱最小化的影响分离，保护柱需要合适的装配。显然，保护柱安插在进样口和分析柱之间，但是如果管路太长（太长或者内径太大），就会造成额外的峰展宽，从而影响分离。系统引入整合保护柱，从以往的报道看，基本上会达到分析柱的最佳水平。但是，整合保护柱基本上和卡式色谱柱捆绑，因此不是那么流行。从操作的角度说，应当在不影响HPLC系统的前提下容易卸下和更换。

理论上，如果保护柱延长了柱长，那么就对色谱分离有额外的塔板数。但就像前面说的，保护柱要么在最佳条件使用，要么在最糟糕的条件下除去。所以保护柱的优势就是延长柱寿命，而没有带来总体分析效率的提高。

博主注：最早接触保护柱，或者叫预柱，实在接触waters设备的时候，两个圆圆的盖子，仪器标配，缺点是不锈钢管路还那么长，简单的保护部分被拉出一大截死体积，后来菲罗门也送保护柱过来了，千把来块钱，一直放着也没有用，说句实话，笔者不是很喜欢用这个做保护，原因就在于觉得影响效果。

误区四：提高温度往往有利于分离效果
否。随着温度升高，流动相粘度下降，因此分析物传质速率提高，所以就能够提供更好的色谱分离效果。正确，但是除了柱效，温度同样影响保留因子（k）和选择性（α）。影响因素能够提高分辨率（其实这也是色谱分析最关心的问题），或者降低分辨率。保留时间往往随着温度升高而降低，因为温度作为一个热力学参数，使得高温度下分析物倾向于留在流动相中，会更快的洗脱出来。但是，不同的化合物，也有可能对于温度有不同的保留程度改变。以analgesics(一种镇痛药，译者注)为例，图二。这一系列的色谱图列出了分析物在柱温20-90°C的情况。我们从中可以发现许多特点。首先，所有分析物随着温度升高，保留时间减低且峰变窄，意味温度升高利于分离效果。其次，salicylic acid（水杨酸即阿司匹林，译者注）在峰5，6之间，随着温度位置改变较大。事实是在20-40°C时，该物质随温度变化，洗脱顺序也发生了变化。所以，温度大于40°C会引起分离时间变短和洗脱顺序变化。

当然，一个提高温度的好处在于降低了操作时的柱压，以便于使用更大的柱流量和更细的填料。

另一个在高温下能够因此柱效的实验参数是流动相的热力学不匹配（互溶问题，译者注）。如果柱子在60°C下操作，但是流动相在室温流入，那么进入的较冷的流动相就能够引起峰变形，原因是不同温度下分析物会趋向在高温的流动相中。所以建议大家使用恒温柱子的时候一定记得流动相要预热。

博主注：温度对出峰时间的影响是显然的，武汉这边的夏天热，液相色谱室这边一般都不愿意把门关上，所以空调以往这边吹，出峰就靠后，waters，agilent 一般没有配柱温箱，varian，岛津的喜欢推广这个，对于稳定保留时间很有作用。不过我觉得平常的实验室，流动相怎么放，色谱柱也怎么放，不然就像上面说的，流动相里的分析物经不起温度的折腾。毕竟不论DAD（PDA）还是UV测得是浓度，变形了测得就不太准了，0.15%很容易突破的。

误区五：碳载量越高，反向色谱柱就越好
否。谈到烷基键合相是，这样的结论肯定是对于链长、载碳量和表面积等有概念误解。通常，真正的反向机理是，保留取决于分析分子的疏水性质，所以保留一般取决于载碳量。载碳量越高，保留越长。载碳量一般与链长对应，但有时候不是。典型的硅胶反应的硅醇含量在8.0 μmol/m2左右，用来键合有机硅试剂。如果对于一个每平方米微孔相同的单层键合相，给定的表面范围，链长越长，载碳量就越大，最终的结果是保留与链长一致。但是对于短链键合相（比如C8），如果基体变面积大，那么键合的碳就会更多，就会可能导致比C18更加长的保留。此外，厂家使用二硅烷和三硅烷，以及聚合物基体也能取得较大的表面积，所以短链聚合相就会在这种情况下带来单联键合所不具有的表面积。对比单体键合相，有时候上述的这些聚合物基体的键合表层较薄，引起传质较慢。

高载量的反向柱更加容易坍塌和反润湿。对于这些柱子，当环境水样中的机修饰剂降到10%的时候，类油的疏水固定相就会变得自我关联（self-associate），而不是作为极性溶液（即相似相溶）。所以，在此情况下，高碳载量理应并不利于反向色谱也不利于色谱重现性。

博主注：卖主子的公司都喜欢谈论这个指标，什么资生堂，迪马的柱子在介绍的时候碳载量是放在显著的位置的。平心而论，碳载高的柱子制造难度大，同时分析我手上小分子的时候还真是好些，目前还没有发现碳载高的柱子塌掉的情况，可能做的还不够多吧。

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『博主翻译』HPLC柱十大误区[下]
误区六：使用小粒径的分析效果好
误区七：对于硅胶填料，硅醇基是拖尾的原因
误区八：硅胶填料只能够在pH2到7使用
误区九：当代HPLC柱至少应该承受1000次进样
误区十：色谱柱通常应该紧盖，以气体损害

学习了，谢谢楼主。

很强悍！！！

认真学习。

很多都是打破常规的说法。

楼主的文章很新颖，学习了

是不是别人的哦，内容不错，是原创就好了

期待误区六至十，楼主尽管上传

对于保护住，俺补充一点，首先保护住肯定会影响到分离，我们可以想办法使它出现有利于我们的情况。


比如，你在分离某几个杂质，有几个C18柱分离比较好，某几个也许苯基柱比较好，这样的情况下，你可以选择C18的保护柱，然后用苯基柱分离（或者反过来，取决于你手头有什么家伙），不止是这样，只要流动相匹配，什么离子交换，CN的柱子都可以试，当你对某个杂质束手无策的时候，这会是你的一个选择。

学习了确实很独特,期待后续

感謝大大分享!