【征集】甲型H1N1流感来袭,有哪些仪器和耗材可供采购检测用？（涵盖了分析方法及必须购买的仪器药品清单）

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何谓猪流感？
猪流感是一种由A型流感病毒引起的猪呼吸系统疾病，该病毒可在猪群中定期造成流感暴发。猪流感病毒在猪群当中引起的发病率较高，而死亡率则较低。猪流感病毒可全年在猪群当中传播，但大部分暴发都发生在秋季末期和冬季，这一点与人群中暴发的情形类似。经典的猪流感病毒（A/H1N1型流感病毒）于1930年在一头猪身上首次分离得来。
现有多少种猪流感病毒？
与所有流感病毒一样，猪流感病毒也不断发生变化。猪可感染禽流感和人流感病毒以及猪流感病毒。当来自不同物种的流感病毒令猪受到感染时，这些病毒便会重组（即：交换基因），于是便会出现一种混合了猪流感病毒、人流感病毒和/或禽流感病毒的新型病毒。多年来，猪流感病毒已出现不同的变化。目前，已从猪身上分离得到四种主要的A型病毒的亚型：H1N1、H1N2、H3N2和H3N1。不过，在最近从猪身上分离得到的流感病毒中，大部分都是H1N1型病毒。


人会感染甲型H1N1流感吗？
甲型H1N1流感病毒通常不会感染人类。但是，已出现散发的人感染甲型H1N1流感病例。这些病例常见于与猪直接接触的人之中（比如：集市里生猪附近的孩童或养猪场里的工人）。另外，已有记载有人将甲型H1N1流感传染给他人的病例。譬如，1988年在威斯康星州生猪群中暴发的明显的猪流感疫情导致多起人感染病例，尽管未造成社区性暴发，但还是有抗体证据表明病毒从患者身上传播至与患者发生密切接触的医护人员身上。
人感染甲型H1N1流感病例是否常见？
以往，美国疾控中心（CDC）每一到两年都会接到在美国发生约1起人感染甲型H1N1流感病毒的病例报告，但在2005年12月至2009年2月这段时间里，已接到12起人感染甲型H1N1流感病例的报告。
人感染甲型H1N1流感有何症状？
人感染甲型H1N1流感出现的症状与常规的人类季节性流感症状相似，包括发热、嗜
睡、食欲不振和咳嗽。有些人感染甲型H1N1流感后还会出现流鼻涕、喉咙痛、恶心、呕吐和腹泻等症状。
人食用猪肉是否会感染甲型H1N1流感？
不会。甲型H1N1流感病毒不会通过食物传播。因此，人不会因为食用猪肉或猪肉制品而感染甲型H1N1流感。食用处理得当且烹熟的猪肉和猪肉制品是安全的。将猪肉烹至内部温度达160℉，即可杀死甲型H1N1流感病毒及其他细菌和病毒。
甲型H1N1流感是如何传播的？
流感病毒可直接从猪身上传播至人身上，亦可从人身上传播至猪身上。当人接近受感染的猪时，比如在猪圈和集市里包括猪在内的牲畜展品，那么人就很有可能从猪身上感染流感病毒。甲型H1N1流感也可以在人与人之间传播。据说这与人间季节性流感的传播方式相同，后者主要是通过感染流感病毒的人的咳嗽或喷嚏进行人际传播的。人可能因接触到含有流感病毒感染的某个事物后再接触口鼻而受到感染。
我们知道哪些关于甲型H1N1流感在人际间传播的信息？
1988年9月，身体一向健康的32岁孕妇因肺炎住院接受治疗，并于8天后死亡。从其身上检测到H1N1猪流感病毒。患者在患病前四天，曾参观过县集市的生猪展览，那里的生猪当中曾出现大规模的流感样疾病。
在后续研究中，76%的受检测生猪展品存在甲型H1N1流感病毒的抗体证据，但在这一群体中并未检测到严重疾病。补充研究表明，与该患者发生接触的一至三名医护人员患上轻微的流感样疾病，且存在感染猪流感的抗体证据。
如何诊断人感染甲型H1N1流感病例？
诊断A型甲型H1N1流感感染病例，通常需要在患病后的前四到五天之内采集呼吸样本（这时候受感染者最有可能排出病毒）。但是，有些人，尤其是儿童，可能会在10天或更长时间里排出病毒。鉴定A型甲型H1N1流感病毒，需要将样本送至CDC作实验检测。
现有何种药物可治疗人感染甲型H1N1流感病例？
现有四种抗病毒药物在美国获准用于流感的治疗，它们分别是金刚烷胺、金刚乙胺、奥塞他韦和扎那米韦。虽然大部分甲型H1N1流感病毒对四种药物都很敏感，但从人身上分离得到的最新的七种猪流感病毒却对金刚烷胺和金刚乙胺有抗药性。
目前，CDC建议使用奥塞他韦或扎那米韦治疗和/或预防感染猪流感病毒病例。

还有其他猪流感病毒暴发的实例吗？
最广为人知的可能是1976年新泽西州迪克斯堡的士兵当中暴发猪流感。x光证据表明，病毒导致至少四名士兵患上肺炎，一人死亡；所有患者以前均身体健康。病毒在基本训练环境中因密切接触而传播，在基本训练小组以外的传播很有限。病毒据说传播了一个月，然后便消失了。病毒源头、进入迪克斯堡的准确时间以及限制其传播和持续时间的因素均不得而知。迪克斯堡暴发可能是因动物病毒在冬季里被引入至拥挤设施内发生密切接触的压抑人群中而导致的。从一名迪克斯堡士兵身上采集到的A型猪流感病毒被命名为A/新泽西/76（Hsw1N1）。
甲型H1N1流感病毒是否与人类H1N1型病毒相同？
不相同。甲型H1N1流感病毒在抗原方面与人类H1N1型病毒截然不同，因此，用于人类季节性流感的疫苗不会起到防治H1N1猪流感病毒的作用。
猪流感在猪群间是如何传播的？
猪流感病毒据说主要是通过猪群间密切接触传播的，并且可能来自在受感染生猪和未感染生猪间移动的被污染物体。连续感染猪流感的猪群和接种猪流感疫苗的猪群可能有个别患病，或者可能仅出现轻微或没有出现感染症状。
生猪中出现猪流感的迹象是什么？
生猪中出现猪流感的迹象包括突然发热、萎靡不振、咳嗽（吼叫）、鼻或眼部流出分泌物、喷嚏、呼吸困难、眼红或眼部发炎以及不进食等。
猪流感在生猪群体中是否常见？
H1N1和H3N2型猪流感病毒在美国和经常从事该行业的某些地区的生猪群体中属于地方病。猪群中的暴发通常发生在天气严寒的月份（秋季末期和冬季），向易受感染的猪群中引入新的生猪时有时也会发生暴发。研究表明，H1N1型猪流感在世界各地的生猪群体中很常见，其中有25%的动物显示出感染的抗体证据。在美国，研究表明30%的生猪群体中存在已感染H1N1型病毒的抗体证据。具体说来，美国中北部有51%的生猪已表现出感染H1N1型病毒的抗体证据。人感染H1N1型猪流感病毒的情况较为罕见。目前尚没有方法将专为接种流感疫苗而制备的抗体和专为治疗感染H1N1型猪流感病例而制作的抗体区分开来。
虽然人们都知道至少自1930年以来H1N1猪流感病毒一直在生猪群体中传播，但H3N2型流感病毒直到1998年才开始在美国的生猪当中传播。H3N2型病毒最初是从人类传播至猪群中的。目前的H3N2型猪流感病毒与人类H3N2型病毒具有密切关系。
是否有治疗猪流感的疫苗？
目前，可为生猪注射疫苗，藉以预防猪流感。不过，尚没有疫苗可预防人类感染甲型H1N1流感。季节性流感疫苗将有可能对H3N2型猪流感病毒起到部分抵抗作用，但却对甲型H1N1病毒无效。



用于流感、禽流感、手足口、猪流感等呼吸道及肠道病毒的鼻部及咽部采样及运送内含无菌的塑料杆尼龙植绒采样拭子1支及内装病毒采样液的采样管1支。


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甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案

一、标本的采集种类和要求
1、推荐采集的呼吸道标本种类
疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
2、拭子的选择
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）
3、临床标本储存要求
保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理
标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输
疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。
二、核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：
4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：
目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。
三、病毒分离鉴定
可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。
四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全
（一）实验室级别及个人防护
1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。
2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。
（二）健康监测
1、所有人员均应自测发热及其他症状。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。
3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)
本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
（一）前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）实验原理
实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
（三）使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
（四）生物安全要求
样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
（五）样本要求
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不当样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure $$lc RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。
（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。

二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、双重标记探针(10μM)；
5、阳性对照。
（二）供给
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2ml PCR 反应管盘；
5、光学反应盖板；
6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1. 微量离心机；
2. 漩涡振荡器；
3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
（一）准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）Real time RT-PCR的试剂
（1）将Master Mix和酶置于冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。