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【原创】蛋白质纯化技术简述

生命科学仪器综合讨论

  • 这个贴作为“蛋白质重组表达研究简述--从基因克隆到蛋白纯化及功能研究”一贴的分支内容。

    因为蛋白质纯化技术本身就是一个比较复杂的技术,内容涵盖很多,因此我觉得单独作为一贴来简述更加合适。

    先传两张仪器的照片,AKTA基本上垄断了做蛋白纯化的仪器设备。

    FPLC,功能比较适中的纯化设备,一般的蛋白纯化需要可以满足。比Primer要强大。



    exploer 100,属于满足中试要求的纯化设备,流速最大100ml/min。


  • 该帖子已被版主-dong3626加10积分,加2经验;加分理由:谢谢分享经验!
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    第1楼2009/06/16

    蛋白质的制备一般分为以下四个阶段:选择材料和预处理,细胞的破碎及细胞器的分离,提取和纯化,浓细、干燥和保存。
    一般纯化蛋白之前都是样品的处理,有很多种不同来源的蛋白。例如:从植物提取,从动物组织提取,或者血清中。这些基本都是天然蛋白。目前,一般研究的蛋白都是实验室发酵培养的。
    微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料,所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物,应注意它的生长期,在微生物的对数生长期,酶和核酸的含量较高,可以获得高产量,以微生物为材料时有两种情况:(1)得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等;(2)利用菌体含有的生化物质,如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳,脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同,其中所含生物大分子的量变化很大,另外与季节性关系密切。对动物组织,必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料,先进行绞碎、脱脂等处理。另外,对预处理好的材料,若不立即进行实验,应冷冻保存,对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

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    第2楼2009/06/16

    例如:大肠杆菌或者酵母发酵。在获得到到大体积的发酵液或者细胞破碎液后,首先需要离心。对于直接发酵液处理相对比较容易一些,只需要离心去掉培养菌就可以了,5000rpm基本上就够了。对于细胞破碎液离心力要求高一些,一般10000rpm。可能部分实验室条件比较好,有比较大的离心机,1L,4L或者更大的,这样相对比较轻松些。但是有些条件相对比较差一点就麻烦一些,可能一次离心仅200ml。

    通过离心获得的上清液需要立即放到4度保温,否则培养菌容易再次大量生长。

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    第3楼2009/06/16

    关于细胞破碎的方法


    1、超声波处理法:此方法为目前实验室研究最常用的方法。
    用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

    2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。

    3、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

    4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。

    5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。

     无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。

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    第4楼2009/06/17

    植物组织蛋白质提取方法 (summer)

    三氯醋酸—丙酮沉淀法
    1、在液氮中研磨叶片
    2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。
    3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1 小时),然后真空干燥沉淀,备用。
    4、上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用。
    5、用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用。
    药品:
    提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
    裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。

    这种方法针对双向电泳,杂质少,离子浓度小的特点!当然单向电泳也同样适用,只是电泳的条带会减少!

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    第5楼2009/06/17

    大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液,少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中,因些,可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

    但是,蛋白质提取时的一点小注意



    一、水溶液提取

      稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂,通常用量是原材料体积的1-5倍,提取时需要均匀的搅拌,以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面,多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(4度4)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制剂(如二异丙基氟磷酸,碘乙酸等)。


    1、pH值
      蛋白质,酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

    2、盐浓度
      稀浓度可促进蛋白质的溶,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。


    二、有机溶剂提取

      一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂,它们具的一定的亲水性,还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越,一是因为丁醇亲脂性强,特别是溶解磷脂的能力强;二是丁醇兼具亲水性,在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外,丁醇提取法的pH及温度选择范围较广,也适用于动植物及微生物材料。

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    第7楼2009/06/26

    蛋白质提取后,很重要的环节就是浓缩了。因为,提取后的蛋白浓度往往都是很低的,而且体积也很大,直接进行下一步的分离纯化不大现实。

    现介绍几种常用的浓缩技术:

    (一)透析袋浓缩法

    利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替),扎口,把高分子聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30%-40%浓度的溶液,将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后,可放入温箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。

    (二)冷冻干燥浓缩法
    这是浓缩蛋白质的一种较好的办法,它既使蛋白质不易变性,又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻,然后移置干燥器内(干燥器内装有干燥剂,如NaOH、CaCl2和硅胶等)。密闭,迅速抽空,并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便,应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥

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    第8楼2009/06/26

    (三)超滤膜浓缩法

    此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出,而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩:一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内,在不断搅拌之下过滤;另一种是将蛋白液装入可离心的膜管中,通过离心力将液体渗透出,蛋白质则被截留住。

    主要依据蛋白质分子量选择一定孔径的膜。目前常规的有截留分子量为3000,10000,50000,100000等多种。

    此种浓缩方法由于方便,快捷,因此实验室基本上都采用此种浓缩方法。
    目前,市场上此类产品做得最好的应当属milipore。

    型号一,主要用于以升为单位的体积浓缩



    型号二 ,利用气压式,主要用于以ml为单位体积的农速



    型号三,利用离心力作用。主要用于ml以下


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    第9楼2009/06/26

    补充一些超滤膜的相关资料

    膜技术是一门崭新的跨学科实用技术,膜分离过程是一种无相变、低能耗物理分离过程,具有高效、节能、无污染、操作方便和用途广等特点,半个世纪以来,膜技术已在许多领域中得到广泛地应用,被公认为是当代最有前途的高新技术之一,超滤膜从20世纪90年代得到广泛应用。
    超滤是介于微滤和纳滤之间的一种膜过程,平均孔径在3-100nm之间。超滤膜技术是一种能够将溶液进行净化、分离、浓缩的膜分离技术。其截留机理主要是筛分作用,但有时膜孔径既比溶剂分子大,又比溶质分子大,故膜表面的化学特性(膜的静电作用)也起着截留作用。以膜两侧的压力差为驱动力,以超滤膜为过滤介质,在一定的压力下,当水流过膜表面时,只允许水及低分子量溶质通过,从而达到溶液的净化、分离、与浓缩的目的。

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    第10楼2009/06/26

    超滤膜包一般均可反复使用, 因此摸索适合的膜包清洗、保存及消毒方法是保证产品质量、延长膜包寿命的重要环节。


    完整性检测 一般在超滤器使用前 (清洗后)产品滤过完成后,
    推荐对超滤膜包进行完整性检测,以确认膜包的
    完整性,保证滤过产品质量。




    使用前: 超滤膜出厂时均含有保湿剂,以保持膜包性状的稳
    定请在使用前用蒸馏水或缓冲溶液冲洗。

    使用后: 可根据情况选择以下溶液进行清洗0.1-0.5N NaOH;10-60分钟。


    保存 超滤膜包必须在下列溶液中湿态保存:0.05-0.1N NaOH;
    15%甘油+0.05%
    叠氮化钠,最佳保存温度4-15℃,最高25℃,最低4℃。
    实验室常用20%乙醇浸泡保存

    消毒 超滤膜不可高温高压灭菌,如有必要可使用70%的酒精
    或200ppm的次氯酸钠杀菌。

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