【线上讲座】毛细管区带电泳分离手性药物的影响因素（讲座PPT已经发在51楼，欢迎大家阅读）

目录
1、毛细管电泳技术发展简史
2、毛细管电泳的基本原理
3、毛细管电泳的分离模式
4、毛细管区带电泳速度的影响因素
5、毛细管区带电泳分离手性药物的影响因素
6、毛细管电泳的发展趋势

特邀佳宾：
毛细管电泳色谱版面专家：


提问与参与细则：
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本帖为大家问题汇集帖

一、电泳技术发展简史

1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。
从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。

二、毛细管电泳的基本原理
毛细管电泳又称高效毛细管电泳，它是在熔融的石英毛细管（内径为25~100m）中进行电泳，其管内填充缓冲液或凝胶，是近年来进展最快的分析方法之一。毛细管电泳是电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，它具有效率更高、速度更快、样品和试剂消耗量特少的特性。
毛细管电泳仪的基本结构（如图一）：

高压电极槽与进样机构 2、填灌清洗机构 3、毛细管 4、检测器
5、铂丝电极 6、低压电极槽 7、恒温机构 8、记录/数据处理
图1毛细管电泳仪的基本结构
毛细管的结构：毛细管电泳通常使用内径为25~100μm的弹性（聚酰亚胺）涂层熔融石英管。

毛细管的特点是：容积小；侧面/截面积大而散热快、可承受高电场；可使用自由溶液、凝胶等为支持介质；在溶液介质下能产生平面形状的电渗流。
在电泳过程中，毛细管两端插入电极液，此电极液通常与管中的缓冲液一致。正负电极连接至高电压装置，进样时样品盘移动，使毛细管的进样端及此端的电极准确插入样品管中，给予一定电场或压力后，样品被吸入毛细管内，然后再将毛细管移至电极液中开始电泳。
在毛细管电泳中，为了维持电荷平衡，溶液中的正离子吸附至石英表面形成双电子层，当在毛细管两端施加电压后，这层正离子趋向负极移动，并带动毛细管中的溶液以液流形式移向负极（电渗） 。
由于毛细管的表面积与体积比大，加上电泳时使用了高压，电渗在毛细管电泳中具有两大特点：液体沿着毛细管壁均匀流动，其前沿是平的；携带不同电荷的分子朝一个方向移动，中性分子也能随着电渗一起移动而实现分离。

三、毛细管电泳的分离模式
1、毛细管区带电泳
毛细管和电极槽内充有相同组分和相同浓度的电解质溶液（缓冲液）。它是最基本、应用最普遍的一种分离模式，尤其对于亲水多肽的分离具有一定的优越性。
2、胶束电动力学毛细管色谱
通常有一些离子型表面活性剂（如SDS）加到缓冲液中，这类分子一端为亲水基团，其余部分为疏水内核，亲水基团在表面，中性粒子因其本身疏水性不同而得以分离。
3、毛细管等电聚焦
选用内壁中性共价涂层消除电渗的毛细管，利用两性电解质形成pH梯度。CIEF具有较高的分辨力。
4、毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis, CGE）
在毛细管内填充多孔性凝胶或其它筛分介质，将电泳和凝胶色谱分离模式相结合。
5、毛细管等速电泳（Capillary Isotachophoresis, CITP）
采用非连续的电解质溶液，即两种淌度差别大的缓冲体系分别构成前导离子和尾随离子，将样品离子夹在中间。
6、毛细管电渗色谱（Capillary Electroosmotic Chromatography, CEC）
把毛细管电泳和毛细管液相色谱结合起来的一种分离技术。

四、影响电泳速度的因素
电泳速度与电泳迁移率是两个不同的概念，电泳速度是指单位时间内移动距离(cm/t)，而迁移率是指单位电场强度下的电泳速度(cm2/ν•t)。但二者又是密切相关的，电泳速度越大，迁移率也越大。影响电泳速度的因素有：
1、样品
被分离的样品带电荷量多少和电泳速度的关系成正比。带电荷量多，电泳速度快，反之则慢。此外，被分离的物质若带电量相同，分子量大的电泳速度慢，分子量小的则电泳速度快，故分子量大小与电泳速度成反比。球形分子的电泳速度要比纤维状的快。
2、 电场强度
电场强度是每厘米的电位降。例如支持体为滤纸时，纸的两端分别浸入电极溶液中，电极缓冲液与纸的交界面间的长度为20cm，测得电位降为200V，则纸上电场强度为10V/cm。电场强度愈高，带电质点移动速度也愈快。根据电场强度的大小，可将电泳技术分为常压电泳(100~ 500V)和高压电泳(500~1000V)，前者电场强度一般为2~20V/cm，后者为20~100V/cm。常压电泳分离时间长，约需数小时到数天；高压电泳分离时间短，有时仅需数分钟。根据需要，人们也可将常压电泳滤纸两端的距离缩短。如使用5cm长的距离，外加电压仍用200V，则电场强度为40V/cm，电流速度加快。常压纸上电泳常用于蛋白质等大分子物质的分离；高压纸电泳则多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等电荷量较小的小分子物质。
3、缓冲液
缓冲液能使电泳支持介质保持稳定的pH，并通过它的组成成分和浓度等因素影响着化合物的迁移率。
（1）pH 溶液的pH值决定物质解离程度，即决定该物质带净电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等两性电解质来说，缓冲液的pH值距等电点(pI)越远，质点所带净电荷越多，电泳速度也越快；反之则越慢。因此，当分离蛋白质混合液时，应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷的量差异增大，以利于分离。通常血清蛋白电泳时，采用pH8。6的缓冲液，pH值大于血清中各种蛋白质的等电点，所以蛋白质均带负电荷，故向正极移动。一般常用的电泳的缓冲液pH范围在4。5~9。0。
（2）成份 通常采用的是甲酸盐、乙酸盐、柠檬盐、磷酸盐、巴比妥盐和三羟甲基氨基甲烷—乙二胺基四乙酸缓冲液等。要求缓冲液的物质性能稳定，不易电解。血清蛋白分离时最常用的是巴比妥—巴比妥钠组成的缓冲液。硼酸盐缓冲液常用于碳水化合物的分离，因为它们能和碳水化合物结合产生带电的复合物。
（3）浓度 缓冲液的浓度可用摩尔或离子强度(I=1/2∑CZ2)表示。离子强度增加，缓冲液所载的分电流也随之增加，样品所载的电流则降低，因此，样品的电泳速度减慢。但要注意的是离子强度增加使电泳时的总电流和产热也增加，对电泳不利。在低离子强度时缓冲液所载的电流下降，样品所载的电流增加，因此加快了样品的电泳速度；低离子强度的缓冲液降低了总电流，结果减少了热量的产生。但是带电物质在支持介质上的扩散较为严重，使分辨力明显降低。
所以对缓冲液离子强度的选择，必须两者兼顾，一般是在0。02~0。2M之间。
4、支持介质
对支持介质的要求是应具较大惰性的材料，且不与被分离的样品或缓冲液起化学反应。此外，
还要求具有一定的坚韧度，不易断裂，容易保存。由于各种介质的精确结构对一种被分离物的移动速度有很大影响，所以对支持介质的选择应取决于被分离物质的类型。
（1）吸附 支持介质的表面对被分离物质具有吸附作用，使分离物质滞留而降低电泳速度，会出现样品的拖尾。由于对各种物质吸附力不同，因而降低了分离的分辨率。滤纸的吸附性最大，醋酸纤维素薄膜的吸附作用较小，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的吸附作用更小。


（2）电渗 在电场中，在液体对固体的相对移动称为电渗(图3)，它是由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起的。水是极性分子，如滤纸中含的羟基使表面带负电荷，与表面接触的水溶液则带正电荷，溶液向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳时分离物质的电泳速度也受电渗的影响。如血清蛋白低压电泳，在巴比妥盐缓冲液pH=8.6、离子强度I=0.06的条件下进行，蛋白质的移动方向与电渗现象的水溶液移动方向相反，蛋白质电泳泳动的距离等于电泳泳动距离减去电渗的距离，使电泳速度减慢。如果二者移动方向相同，蛋白质泳动距离是二者之和，则电泳速度加快。用琼脂凝胶作为支持介质，因琼脂中含有较多的硫酸根，固体表面带较多负电荷，电渗现象明显。在pH8.6的条件下电泳，许多球蛋白均向负极移动，因电渗移动的距离大于电泳距离，这个原理是对流免疫电泳的理论基础。
电渗现象可用不带电的有色颜料或用有色的葡聚糖点在支持介质的二端中间，经电泳后可观察电渗作用对这些物质的移动方向和距离。
（3）分子筛效应 有些支持介质如聚丙烯酰胺凝胶是多孔的，带点粒子在多孔的介质泳动时受到多孔介质孔经的影响。一般来说，大分子在泳动过程中受到的阻力大，小分子在泳动过程中受到的阻力小，有利于混合物的分离。
5、温度对电泳的影响
电泳时电流通过支持介质可以产生热量，按焦耳定律，电流通过导体时的产热与电流强度的平方、导体的电阻和通电的时间成正比(Q=I2Rt)。产生热量对电泳技术是不利的，因为产热可促使支持介质上溶剂的蒸发，而影响缓冲溶液的离子强度。若产热温度过高可导致分离样品变性而使电泳失败。温度升高时，介质粘度下降，分子运动加剧，引起自由扩散变快，迁移增加。温度每升高1度，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，也可在电泳系统中安装冷却散热装置。对高压电泳增设冷却系统，以防样品在电泳时变性。

五、毛细管电泳检测技术

CE对检测器灵敏度要求相当高，故检测是CE中的关键问题。迄今为止除了原子吸收光谱与红外光谱末用于CE外，其它检测手段均已用于CE。现选择重要的几类检测器介绍其最新进展。
1、紫外检测器(UV)
UV检测器集中在提高灵敏度，如采用平面积分检测池，这种设计可使检测光路增加到1cm。也有用光散射二极管(LEDS)作光源，其线性范围和信噪比优于汞灯。总体来说进展不大。
2、激光诱导荧光检测[LIF]
LIF是CE最灵敏的检测器之一，极大地拓展了CE的应用，DNA测序就须用LIF，单细胞和单分子检测也离不开LIF。LIF不但提高了灵敏度，也可增加选择性，缺点在于被测物须用荧光试剂标记成染色。利用CE-LIF技术可检出染色的单个DNA分子，向癌症的早期诊断及临床酶和免疫学检测等方向进行。CE/LIF向三个方向发展:在原有氦—镉激光器(325nm)和氩离子激光器(488nm)之外，发展价廉，长波长的二极管激光器;发展更多的荧光标记试剂来扩展应用面;开展更多的应用研究。CE/I''''IF和微透析结合可测定脑中神经肽。采用波长分辨荧光检测器可提供有关蛋白和DNA序列的一些结构和动态信息。一些适用于二极管激光器的荧光标记试剂如CY—5等，正在不断开发和应用。
3、CE/MS联用
将现在最有力的分离手段CE和能提供组分结构信息的质谱联用，弥补了CE定性鉴定的不足，故发展特别快。CE/MS联用主要在两方面发展:一是各种CE模式和MS联用，二是CE和各种MS联用。关键是解决接口装置。成功地应用到CE/MS接口中的离子化技术有电喷雾(ESI)，大气压化学电离(APCI)，离子喷雾(ISP)，连续流快原子轰击(CF-FAB)，基体辅助激光解吸离子化(MALDI)，等离子体解析(PD)，音波喷雾离子化(SSI)等。六种CE模式均已和MS联甩。最早报道CE/MS联用是采用单级四极杆质谱，现已发展到三级四极质谱，离子阱质谱，时间飞行质谱(TOF/MS)，电感锅台等离子体质P谱(ICP/MS)，磁质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR/MS)等。CE/MS联用特别适合于复杂生物体系的分离鉴定。因所需样品少，目前大部分工作集中在基因工程产品和蛋白样品，如用CIEF-ESI-MS监测蛋白的去折迭过程，各种方法联用综合评价基因工程药物—促红细胞生成素(EPO)等。CE-ICP-MS进行元素分析，联接CE-TOF-MS的新的激光蒸发离子化接口以及用CE-FTICR-MS成功地分离和鉴定单个红细胞中血红蛋白的α和β链等，表明CE/MS联用已成为CE研究中的热点，CE/MS联用在中药复杂体系分离分析中将起重要作用。
4、电化学检测器(EC)
EC可避免光学类检测器遇到的光程太短的问题，故和LIF同为CE中灵敏度最高的检测器。报道最多的是电化学伏安检测器，常用碳纤维微电极进行单细胞极微量神经递质(如多巴胺等)的测定。可用脉冲伏安法测定糖，糖肽及金属离子，也可用循环伏安法，另一类常用的EC为电导检测器，Li 的检测限达10-7mol/L(10-15mol)。
5、化学发光检测器(CL)
CL具有结构简单，灵敏度高的特点，近年来引起重视。用CE—CL检测血红蛋白，其检测限比CE—UV降低约4个数量级。应用最多的仍是鲁米那(luminol)体系，因该体系对多数待测物如一些金属离子，氨基酸及其衍生物的检测灵敏度很高，且反应在水相进行。电致化学发光(ECL)也已成功地用作CE检测。鲁米那等发光标记物在蛋白及基因的CE—CL检测中可能有很大的潜力，预计将会得到进一步发展。
6、其它检测器
采用激光作激励源的除LIF外，还有激光热透镜检测，激光光热检测和激光拉曼检测等。普通荧光检测器研究集中在开发新的荧光染料，以提高灵敏度。同位素检测器具有高选择性和高灵敏度〔可达10-9mol/L〕，但测定时需经同位素标记步骤，故应用受到限制。
总之，检测器是CE中具有挑战性的研究工作。CE/MS联用是最有应用价值的检测器，但价格昂贵，不易推广。发展新型检测器，提高UV等检测器灵敏度，以及发展CE和其它分离方法，检测方法的联用是CE研究重点之一。

六、毛细管电泳发展趋势


CE的应用十分广泛，现择一些重要应用及重要发展作简要介绍。
1、DNA分析
DNA分析包括碱基，核苷，核苷酸，寡核苷酸，引物，探针，单链DNA，双链DNA(DNA片段，PCR产物)分析及DNA序列测定。CZE和MECC通常用来分离碱基，核苷酸，简单的核苷酸等。CGE则用于较大的寡核苷酸，ssDNA，dsDNA和DNA序列分析。大片段DNA分析过去颇为困难，但又十分重要，因为人类染色体DNA在50—255Mbp范围内，用荧光显微镜可观察到单个大片段DNA分子的分析过程，对长度为166k碱基(bp)的T4dcDNA经消解后，从1.26到49.31kbp的8个片段只用8min就可分离。也有报道用CE结合原子力显微镜可进行单个DNA分子的分价。已有CE测定DNA序列的商品仪器面市，但快速测定DNA序列仍在研究中。采用毛细管电泳芯片，可更换的线性聚丙烯酰胺凝胶，350bp的DNA序列测定可在7min内完成，最小分离度为0.5。也有采用舰CEC—MS来研究带电和中性RNA和DNA的加合物。
DNA分析中CE分离，鉴别PCR扩增产物及DNA基因突变是其重要发展方向。CE用于点突变测定有单链构象多态性分析(SSCP)和限制片段长度多态性分析(RFLP)等。CE也用于法医领域亲子鉴定和甄别罪犯等。
2、肽和蛋白分析
CE在生物大分子蛋白和肽的应用可概括为两大方面：一是其结构的表征，二是研究相互作用。蛋曰质一级结构表征的内容包括纯度，含量，等电点，分子量，肽谱，氨基酸序列和N—端序列的测定等，CE已广泛用作最有效的纯度检测手段，它可检测出多肽链上单个氨基酸的差异。用CIEF测定等电点，分辨度可达0.01pH单位。尤其是肽谱用CE/MS联用进行分析，可推断蛋白的分子结构。蛋白结构的完全表征尚需采用多种CE模式，结合多种仪器联用，特别是和MS，TOF/MS的联合使用或联用，才能得到正确结果。蛋白，特别是基因工程所得蛋白药物的微多样性(非均一性)是影响其质量的因素之一。CE能较好地显示微多样性。用CE进行蛋白本身反应及和小分子相互作用研究是研究热点，如蛋白结合或降解反应，酶动力学，抗体—抗原结合动力学，受体—配体反应动力学等，蛋白和DNA分析始终是CE研究的重点，今后会有更多的研究。
3、手性分离
手性对映体分离，鉴定有巨大的应用价值，已成为医药领域内一个重要课题。第11届国际CE大会(HPCE，98)论文中，手性分离论文约占10%，可见手性分离受到重视。除CIEF外，其余五种模式均可用于手性分离。常用的手性选择剂有环糊精及其衍生物，冠醚类，手性选择性金属络合物，胆酸盐，手性混合胶束，蛋白等。我国在环糊精类衍生物分离手性对映体方面作了大量，深入的研究工作，达到国际先进水平。当前最新进展是采用大环抗菌素作手性选择剂，如用万古霉素，利福霉素，硫酸新霉素，硫酸卡那霉素，瑞斯西丁素等来进行手性分离，并探讨了分离机理。还有采用线性多糖，如角叉菜胶来分离弱碱性手性对映体。CE进行手性分离，通常均在运行缓冲液内加人手性选择剂，在操作及分离效率上均优于HPLC手性分离。今后CF手性分离将会在发展更多手性选择剂，更深入地探讨分离机理及手性药物在体内的作用及代谢等方面开展研究。
4、药物分析和临床检测
目前CE在药物和临床研究领域已成为不可缺少的有力手段，但在医药领域尚未确定为法定方法，故未得到广泛使用。医药领域内大量研究工作表明CE正在走向成熟。CE已用于几百种药物及各种剂型中丰药成分分析，相关杂质检测，纯度检查，无机离子含量测定及定性鉴别等CE成为法定方法，最可能的突破点是手性药物的鉴别；基因工程药物的纯度检测和分子量测定；HPLC或其它方法难于解决的药物质量难题;如主成分峰后尾随的痕量杂质，HPLC难于准确定量，CE高柱效则可迎刃而解。现在采用EOF内标及修正计算峰面积等方法己能很好解决CE定量问题。研制的96支毛细管的CE仪器一旦实现商品化，更有利于CE在制药工业中大规模使用。CE/MS联用将促进CE快速发展。CE在临床化学中除进行临床分子生物学测定外，也广泛用于疾病临床诊断，临床蛋白分析，临床药物监测和药物代谢研究。药物代谢研究对CE是一个挑战，虽有不少成功报道，但在提高灵敏度，解决蛋白吸附等方面仍待改进。
5、环境监测和离子分析
CE在环境监测中的应用也日趋增多，目前主要集中在用各种模式，包括CEC分离监测土壤等环境中多环芳烃(PAHs)，可在10min内分离16种多环芳烃。CE在环境监测中应用还需提高灵敏度和发展浓缩，富集方法。毛细管离子分析(CIA)采用间接紫外法或间接荧光法，具有高效，快速的优势。最成功的例子是2.9min内分离36种阴离子，1.8min内分离19种阳离子。CIA有特色，如在大量有机硒(硒酸酯多糖)存在下，可用CIA法定量测定不同价态的痕量无机硒，这是原子吸收光谱和离子色谱尚未解决的难题，目前CIA及CE/MS用于形态分析报道也日益增多。

CE较重要的应用还有糖的分析，目前最成功的是用APTS作糖的衍生化试剂，标记后用LIF可进行单糖和多糖的测定。
6、单细胞，单分子监测
单细胞，单分子检测是CE研究达到的最高境界，对生命科学和化学有巨大潜在意义。已报道对单个肾上腺细胞，红细胞，白血病细胞，淋巴细胞，嗜铬细胞和胚胎细胞等均取得成功。如用CE测定单个淋巴细胞中的乳酸脱氢酶同工酶抖，用CZE间接紫外法监测钠离子和钾离子透过胚胎组织膜的传送，单细胞监测或许会对细胞水平的药理学，了解生命过程提供—种活体检测手段。单个DNA分子的检测早有报道，最近E。Yeung报道用CE监测单个蛋白分子，是一突破性的进展，表明科学家向研究单分子间的各种化学和生物反应跨出了决定性的一步。
7、毛细管电泳芯片(Chip)
将所有的化学反应都集成在一小块玻璃芯片上，建立有一个实验室功能的芯片将是CE发展的前景，如测DNA序列的芯片在3cm距离内，只加20v/cm的电压，就可在13min内测定400bp的序列，分离度大于0.5，柱效高于3000万理论培板。将PCR和CE集成在—起的芯片也已成功，还有将Chip和MS联用，极大扩展了Chip的前景。虽然目前各种检测器对Chip来说，体积不相称。但随着检测器的微型化(如质谱仪已可做到如手提箱大小)，Chip的优势会更加明显，这也是科学家集中力量发展Chip之理由。
本世纪是生命科学大发展的世纪。完成人类基因组计划后，后基因时代的基因组学和蛋白组学将快速发展，功能基因的分离，检测，功能蛋白的分离，测定对CE提出更高的期望，小chip将是CE发展的一个重要趋向，将一个实验室的工作集成到一块很小的芯片上，能使仪器微形化。可以预见，不久就会出现各种专用的基因检测，疾病诊断的小型chip及仪器。另一方面，96支或更多支毛细管的毛细管阵列电泳仪将会用于药厂中产品质量检测及大量医学临床检验。将会研制适合CE用的各种检测器，以进行单细胞和单分子的检测。单细胞检测为在分子水平上了解细胞的各种行为提供了强有力的工具，而单分子检测为在单个分子水平上开展化学动力学，反应动力学等研究提供了可能性。此外，CE在环境科学中也会有较大发展余地。
CE是正在发展的研究领域，有很多理论及实际问题有待解决，更需其它领域的研究人员来扩大其应用范围。CE的成长将为生命科学，材料科学，环境科学提供又一强有力的研究手段，CE也在不断解决难题的过程中得到发展。

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