【求助】使用反相高效液相色谱法分离混合物时遇到的问题

pan0610

2010/04/15

私聊

液相色谱（LC）

前些时日发帖求助过大家，那些问题后来我也有说明已经基本解决了，再次感谢所有提出建议和方法的朋友。

我这段时间是在做毕业论文，选的是有机方向，结果导师说他希望往其他方面也做些开拓，因此给我们订下的课题是“分离二茂铁衍生物的混合物”。查询了些文献，决定采用反相高效液相色潽法。但因为之前在这块并没有太多接触，导师也是专攻有机合成的，所以在分析这块只能自己摸索和学习。以后有什么问题我会在这里继续请教各位，有的或许显得很业余，希望大家别太见怪。

——写在前面的话

我曾在上一篇帖子中说“当使用等度洗脱的时候，第一个样品峰出现前并无明显的‘杂质峰’或者‘死体积峰’；换成梯度洗脱，不论以什么样的初始比例在什么样的时间梯度内，约1分钟左右都有一个强度不大，但是还算明显，形状也不错的峰。”

后来我开启了柱温箱，设定温度为50°，用梯度单独走了溶剂二氯甲烷，在1min左右出现了一个峰，之后较为平缓，无明显出峰。再调出之前做过的那些等度洗脱图，在1min左右也有很小的波动，似乎可以确认这是溶剂的出峰时间。

今天我们对流动相进行改变，分别用了四氢呋喃—水和乙腈—水这两种二元流动相。之前使用甲醇-水流动相，UVD，254nm，甲醇：水=8：2，流速1ml/min，柱温50°时，大致是在5分钟左右出现第一个样品峰，13分钟左右出完最后一个（总共7种样品混合）。而使用上述两种流动相（其中乙腈-水的比例为7：3，其余条件较甲醇-水不变；四氢呋喃-水的比例为6:4，波长改为260nm，其余条件较甲醇-水不变），基本都在10分钟前出完峰。

问题如下：

1. 采用后面那两种二元流动相，出峰时间明显提前，是否就是因为乙腈和四氢呋喃的洗脱能力较之甲醇来得强？

2. 若是我希望在不改变组成比例的情况下使整体出峰的时间往后移甚至于让峰分得更开，有什么办法吗？能否讲下具体操作？

3. 四氢呋喃和乙腈都是分析纯拿来重蒸的，似乎杂质还是颇多……我们能否用扣除背景的做法来消除杂质影响？

4. 是否高效液相色谱必须得用色谱纯来当流动相……

谢谢大家~

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zhaomeimei

第1楼2010/04/15

1.应该说是乙腈—水(7：3)和四氢呋喃—水(6:4)这两种流动相中水的比例增大,极性强于甲醇-水(8：2),四氢呋喃属于强洗脱剂，洗脱能力大于异丙醇，常用来再生柱子，洗脱强保留组分,在甲醇，乙腈中加入少量THF有时候，有时候会可以改善分离度，四氢呋喃和水混在一起，粘度加大，导致柱压会升高，而且不稳定，用前一定过滤
2.提高分离度方法：一是换不同长度的柱子甚至不同填料的极性柱子（C8 ，C18），二是加酸或缓冲盐，调节流动相PH值，来提高分离度，三还可以改变柱温
3.这个没做过,不好回答
4.色谱纯的试剂对仪器整个管路比较好,不要因小失大

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私聊

〓猪哥哥〓

第2楼2010/04/18

上面的楼主回答的比较细致了。

1. 采用后面那两种二元流动相，出峰时间明显提前，是否就是因为乙腈和四氢呋喃的洗脱能力较之甲醇来得强？
是的，乙腈和四氢呋喃的洗脱能力比甲醇强，而且强很多。而且想四氢呋喃粘性很大。

2. 若是我希望在不改变组成比例的情况下使整体出峰的时间往后移甚至于让峰分得更开，有什么办法吗？能否讲下具体操作？
改变柱长是一个办法。同时降低柱温

3. 四氢呋喃和乙腈都是分析纯拿来重蒸的，似乎杂质还是颇多……我们能否用扣除背景的做法来消除杂质影响？
可以。但是分析纯的杂质多，对仪器，管路有伤害，应该用色谱级的

4. 是否高效液相色谱必须得用色谱纯来当流动相……

长远发展，是的