【第三届原创参赛】2010年度食品微生物学培训笔记

5.    运输（病原微生物）：需要培训及相关方的证书方可运输

6.    病原微生物检测需实行双岗制，相关实验室的活动应两名或两名以上的工作人员共同进行，在同一实验室的同一安全区域内，只进行一类病原微生物的检测工作

7.    实验室建设方面：
1）    生物安全三级。四级实验室应该在明显位置上标示生物安全标识和生物安全实验室级别标志（国务院卫生主管部门等/必须国家批准及通过认可）
2）    BSL-2实验室要求：（1）门牌：未经允许，不得入内（2）实验室外部安装洗眼装置等（3）实验室内不要轻易安装水池，下水道，以免空气潮湿度过大，导致病原微生物的转播（4）BSL-2实验室内必须安装生物安全柜（但是不需要一定安放在无菌室内）（5）室内应该安有排风设备，可排放到室内，但不允许排放到公共管道里。
3）    相关参考资料及文献。附录
《生物安全实验室良好工作行为指南》
《实验室生物危险物质泼洒处理指南》
《资质认定管理条例》（食品安全法）
二.    新版国标GB4789修订情况介绍
1.    版本情况1984年版/1994年版/2003年版/2008年版/2010年版
其中2003年版与1994年版未作改动，只是因为版龄问题，所以更改，2010年版对2008年版很多内容作了删除，2010年6月1号发布了10个标准，新增了GB4789.15

2.    出台背景—关于大肠菌群检测方法（卫生部16号公告）
1）2008年版实施和产品卫生指标中的单位不一致，无法判断。
2）2003年版和2008年版检测方法有时结果不一样，如：03年版40MPN/100g，08年版：0.9MPN/g,2008年版的检测值偏高
3）同样的阳性发酵管数，查MPN表结果也有不同（根据取样量的不同）
如：发酵管数为2（稀释度0.1g）0（稀释度0.01g）0（稀释度0.001g）时，2003年版的结果是90MPN/100g，而2008年版的结果是0.92MPN/g（92MPN/g）
4）    现行食品标准规定的大肠菌群指标为MPN/100g或MPN/100mL为单位，适用于2003年版
5）    以MPN/g，或MPN/mL,CFU/g,CFU/mL,适用于2008年版进行检测（也就是说不同的限量用不同的方法）

3.2010年版食品微生物学国家出台的背景
1）三聚氰胺事件
2）乳制品标准的全面制定
3）食品安全法的出台

4食品安全法2009年6月1日实施，其带来的主要改动和我们应注意的事项有
1）    农残，兽残，重金属，微生物等检测的限量指标的规定
2）    查新方法，需在卫生部网站查新，因为现行标准为卫生部发布，与标准化监管部门无关，标准内容卫生部有时有小的改动，但是其未作认可。
3）    标准相关内容应与食品安全法相一致
4）    所有涉及食品的各类标准应进行整合（卫生部已着手处理）
5）    无国标的可制定地方标准，行标等相应标准
6）    所有标准应免费查阅（关于食品安全方面）

5.2010年版标准特点
1）标准名称：都由食品卫生微生物学检验改为 食品安全国家标准 食品微生物学检验
2)更改的数量有10个，且都与乳制品有关其中2008年版合并（1个），2008年版修订（7个），2003年版修订（2个）

三：GB4789.1-2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 修改要点及解读
1.    标准适用于食品微生物学检验（注：也适用于食源性疾病及食品安全事件，见标准4.2.3及4.3.4）
2.    实验室布局应采用单方向工作流程，即无菌室—培养室—鉴定室—洗刷消毒室的检验流程，但是实际工作中，很难达到这样的要求。

3.    病原微生物分离鉴定工作————不同的病原微生物印在不同级别的实验室进行，见上述介绍的病原微生物分级和生物安全实验室分级
4.    设备：如培养箱的检定，应该对其的温度分布的均匀度,温度的波动度进行检定，检定的周期可无限延长（一般来说2-3年为宜），若培养箱中有2个及以上的温度计，应以一个温度计为准，来做温度监测记录。
5.    培养基：一般实验室进行的应该是针对商业培养基的验收；而培养的质量控制指的的是针对自制培养基而言。
6.    菌株管理规定：致病菌监测必须购买标准菌株，建议ATCC标准菌株
7.    采样方案ICMSF抽样方案：（定于2010年12月1日起在乳制品检验中实行）
1）    实行抽样方案的原因：因为样品中微生物分布的不均匀性及不稳定性，需要很多的样品反映同批样品的性质，同样，这种抽样方法也适用于理化检验。
2）    三级采样方案：n：同一批次样品应采集的样品件数，c：最大可允许超出m值的样品数，m：微生物指标可接受水平的限量值，M：微生物指标的最高安全限量值
例如：婴儿食品的大肠杆菌 n=10，m=10，M=100，c=1 就是指在抽取10件样品中，只能允许有1件样品的大肠杆菌的量在（10，100）之间，而不允许有任何一件样品的值大于或等于100。
3）    二级采样方案：在n个样品中，允许有小于等于c个样品其相应微生物指标检验值大于m值
例如：鸡胴体沙门氏菌限量标准n=51,c=13,m=0
8.    样品的贮存和运输：应该在接近原有贮存温度条件下贮存
9.    检验后样品的处理
1）    明确规定了微生物剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检（但是这是基于样品结果准确无误为前提的基础上的，若是诸如能力验证类的样品或者对结果有怀疑的样品，可以复检）
2）    微生物样品不留样，应采取暂时存放的处理方法，等出具相应报告之后可立即进行处理
3）    凡是经过培养过的培养基，无论是否长菌，必须经过高压灭菌处理，因为其含有高度的营养成分，是微生物喜好生长的温床，极易在其上长满各种病原微生物，属于高危物体

四．GB4789.2-2010菌落总数 修改要点及解读
1.立项修改依据，反应出样品在加工运输贮存中的污染程度，反应了样品的新鲜程度，菌落总数测定值不可单独使用，必须与其他微生物检测指标共同使用
2.修订的背景：旧版标准多年未作修改，也因为其局限性
3.方法特色：
1）培养基的改变情况：有NA（营养琼脂）改为了PCA(平板计数琼脂)，（其实在2008年版已经改为了PCA）改变依据是在PCA环境之下，菌落长得更大，更容易被发现
2）培养基改变的影响：无须对于培养基改变来对能力验证的结果做出判断，不同的方法，使用不同的培养基，就报不同的结果；而原则上GB不做方法确认，只是做验证，证明其新方法在本实验室能有效的使用；但是对于非标方法，必须做方法确认。
3）菌落计算公式的修订，统计学依据
（1）平板菌落数越多，结果越具有代表性。
（2）取样量越大，结果越具有代表性。（同等取样条件下，排除其他方面的干扰因素）
（3）不同的取样量赋予不同的权重，而不是简单的平均值。
4）增加了拍打式均质器的使用和微量移液器（可灭菌）的使用
5）对于菌落总数的概念的理解
2003/2008版本：在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。（嗜中温需氧菌或兼氧性菌）
2010版本：食品检样经过处理，在一定条件下培养后，说得每克（毫升）所得的微生物总和。

6）    质量控制方面，对于方法的重现性：同一方法，不同人员之间比对，根据ISO4833-2003,若两人结果的对数值相差0.25之间，可认定两人结果一致。
如：两人同一方法作出的结果分别为1*105, 和2*106，但是这两个数据的对数值相差在0.25之内，可认定两人结果一致。(当然，这个判断依据的前提是样品相对比较均匀，而含菌量不应太低，至少应在103或104以上)
7）    其他：
（1）    菌落计数的范围，应控制在30—250之间
（2）    空白对照：若空白对照中出现了菌落，也不一定是结果就不可用，若空白的菌未影响稀释倍数时，可用数据（若225mL稀释原液污染，则不可用，因每一次稀释，都会导致污染）
（3）    高压锅检定：进口高压锅不可检定压力，一般实验室用灭菌锅都可算作为简单压力容器，可不做备案及培训。

五.GB4789.3-2010大肠菌群计数 修改要点及解读
1）现方法：是LST—BGLB验证—出具报告，
原方法：初发酵（乳糖胆盐）--EMB分离培养
新方法在LST培养时36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气者则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验，未产气者为大肠菌群阴性。在这里，之所以要继续培养至48h，是为了要修复受损伤的大肠菌群，所以新标准比旧标准的结果要偏高。
2）MPN表的使用：（新旧标准单位不同，而MPN表也有所差异）
如：新表MPN/g 旧表MPN/100g
0.1/0.01/0.001 1.0/0.1/0.01
有小数点 四舍五入归零
从新旧MPN表可以看出，同样的结果，新MPN表的结果要偏大一些
3）第二法：平板计数法乳制品的强制方法，拟定于2010-12-1正式实施，而一般的实验室用不上，且其对于含量较低的大肠菌群检测不出

六.GB4789.10-2010 金黄色葡萄球菌检验 修改要点及解读
1）第一法是针对金黄色葡萄球菌的定性检验，第二法针对含量较多的金黄色葡萄球菌的计算而言，第三法金黄色葡萄球菌MPN计数则是适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌较多的情况。
2）第二法中，样品的接种计数，将每个稀释度吸取1mL样品匀液分别加在三块Baird-Parker平板上，计数时，应该是将3块平板所长菌的总和加以计算。
3）定性检验中，肠毒素方法实用性及适用范围：可疑食物中毒样品，以及针对产生肠毒素的菌株的鉴定。（而附录中葡萄球菌肠毒素检验方法在实际上是不可实现的）

七．GB4789.15-2010 霉菌和酵母计数 修改要点及解读
1）培养温度由原27℃改为28℃±1℃
2）对于霉菌和酵母，采取分别计数的方式（对于霉菌和酵母的界定，属于一个比较模糊的范围，有的霉菌很小，有的酵母也会有长丝，所以对于其的定义，实验室可先明确规定，如只要是有丝的就是霉菌）
3）结果观察的规定，原标准为3d之后开始观察，共培养观察5d，新标准改为培养5d，观察并记录。（是因为霉菌在培养时，若观察就会移动培养皿，这样导致孢子散落，所以改为5d后直接看结果，而新版标准同样有缺陷，有的霉菌经过5d培养之后，有可能长的很大，掩盖了其他菌落，影响结果的判定和观察）
4）稀释样品的时候，应采用无菌水进行稀释，是因为有1-2种的霉菌遇到生理盐水或磷酸盐会死掉；但是在实际检验过程中，可以对此忽略不计
5）菌落计数时，选取菌落数在10CFU-150CFU的平板，此时，很有可能有三个适应的稀释度均落入相应范围，此时没有相应的计算公式。
6）国标漏写一行6.1.2诊断：当两倍稀释度均落入10CFU-150CFU时，参照GB4789.2-2010进行计算。

这些笔记是根据培训记录整理出来的，如果有不对的地方请大家批评指正。

很详细的内容呢！

请您多提宝贵意见啊！大家相互学习啊

这是单位内部的培训吗？

是我们派人参加外部培训，然后回来进行内部培训

很详细的培训资料！