【第三届原创参赛】凯氏（Kjeldahl）定氮法之经验总结

二、实验过程操作

1、主要试剂的配制

40%氢氧化钠：化学纯 400g氢氧化钠溶于1000ml无氨蒸馏水中。

2%硼酸：分析纯 20g硼酸溶于1000ml无氨蒸馏水中。

0.05mol/L盐酸：分析纯 4.2ml盐酸定容至1000ml，通过无水碳酸钠标定。



混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液5份和溶于95％乙醇的0.l％

甲基红溶液1份混合而成．

2、实验过程注意事项

（1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g；半固体试样一般取样范围为2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。

样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低，或者用滤纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除。消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。

（3）消化时，不要用强火。若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。在整个消化过程中保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。海能公司消解炉SH220或SH520能够很好的解决此问题。

（4）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量；加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点；催化剂硫酸铜在有机物全部消化后，溶液显清澈透明的蓝绿色，可用它来指示消化终点。此外，硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。 过氧化氢，为氧化剂，有助于有机物消化，同时可以消除消化过程中的气泡现象。

（5）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH₃)₄]²⁺ ， 加入氢氧化钠是否足量,常常影响整个测定的顺利进行。由反应原理可知，当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使溶液呈淡黑色；当氢氧化钠量不足时就无黑色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色，所以有无氧化铜颜色存在是判断氢氧化钠是否足量的标志。

（6）因蒸馏时反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要发生均匀，充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分钟后关掉热源。蒸馏是否完全，可用精密ＰＨ试纸测冷凝管口的冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。一般情况下建议使用半微量法，因为如果蒸馏失败的话，半微量法还可继续蒸馏，而常量法只好全部重来，费时费力。我们使用海能K9840经过多次蒸馏吸收实验达到理想效果。

（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

（8）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，而以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。另外，硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。

（9）在盐酸标准溶液的配制时，必须将基准无水碳酸钠于270-300℃灼烧至恒重后称取所须用量，否则也会影响蛋白质测定结果的准确性。盐酸标准溶液的浓度，常量法中取0.1M比较合适，半微量法中则在0.02～0.05M之间比较合适。

三、讨论

凯氏定氮法作为目前法定的国标方法与我们的工作密不可分，本文主要通过综述凯氏定氮法操作的细节及注意事项，为关注此检测方法的从业人员提供一定的帮助，从而有效的提高效率。



主要参考文献

[1]GB 5009.5-2010 食品中蛋白质的测定 中国标准出版社，2010.3.26

[2]寇云娟，谭源，韩起文. 牛奶中蛋白质的测定原理及其注意事项<<中国乳业>>2006，7.

[3]蛋白质测定实验研究[J]实验室研究与探讨，2005, 24(4): 58-59

应助达人

知识和经验的一个总结。其实单独的某一条或者某几条，在其他资料上，也可以看到。楼主把这些归纳起来了。
我一直很好奇，为什么管凯式烧瓶叫凯式呢，是KATE发明的烧瓶吗？

想请问楼主：固体样品一般取样范围为0.20g~2.00g，这个范围确实有点宽泛，称取的样品量是不是根据样品的含氮量而定啊？
像乳粉的称样量一般称取多少为宜啊？

“或者用滤纸包裹好一起投入消化，滤纸影响通过空白扣除”，我们一般不用滤纸，用的硫酸纸，个人感觉效果要好一点；

用称量纸也可以。

因为是Johan Kjeldahl 在1883年第一次提出氮的测定方法）a meeting of the Danish Chemical Society

称取的样品量根据样品的含氮量而定,乳粉一般是0.60-0.70g为宜，因为乳粉的蛋白质含量要求不小于12%。标准酸的消耗太小，误差大；取样量太大时实验过程太繁琐。