层析柱规格 | 凝胶的规格和用量(g) | |||||
直径(cm) | 高(cm) | 容量(ml) | G25 | G50 | G100 | G200 |
0.9 | 15 | 9.5 | 2.5 | 1 | 0.6 | 0.3 |
0.9 | 30 | 19 | 5 | 2 | 1.2 | 0.6 |
0.9 | 60 | 38 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 20 | 40 | 10 | 4 | 2.5 | 1.2 |
1.6 | 40 | 80 | 20 | 8 | 5.0 | 2.4 |
1.6 | 70 | 140 | 35 | 14 | 9.0 | 4.4 |
1.6 | 100 | 200 | 50 | 20 | 12.5 | 6 |
2.6 | 40 | 210 | 50 | 20 | 12 | 7 |
2.6 | 70 | 370 | 90 | 35 | 20 | 12 |
2.6 | 100 | 530 | 130 | 50 | 30 | 17 |
老多_小多
第1楼2010/08/25
3.加样与洗脱
(1)加样量:加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小,加样量可小;否则,加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时,若采用28Onm波长测定吸光度,对一根2cm×6Ocm的柱来说,加样量需5mg左右。一般来说,加样量越少或加样体积越小(样品浓度高),分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5%~10%。样品体积过大,分离效果不好。
对高分辨率的分子筛层析,样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定,故高吸水量凝胶如Sephadex G-200,每mL总床体积可加0.3~0.5mg溶质,使用体积约为0.O2倍总体积;而低吸水量凝胶如Sephadex G–75,每mL总床体积加溶质质量为0.2mg,样品体积为0.Ol倍总体积。
(2)加样方法:如同离子交换柱层析一样,凝胶床经平衡后,吸去上层液体,待平衡液下降至床表面时,关闭流出口,用滴管加入样品液,打开流出口,使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时,小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。
(3)洗脱:加完样品后,将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连,根据被分离物质的性质,预先估计好一个适宜的流速,定量地分部收集流出液,每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。
凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液,有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置,可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多,最好为床体积的1%~5%,最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大,浓度过大粘度大,分离效果差,一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致,否则更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14Mol/L NaCl)。