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【第三届原创参赛】黄酮类化合物的分离体会

幽灵龙猫

2010/09/19

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黄酮类化合物的分离体会

【黄酮类化合物简介】

黄酮类化合物（flavonoids）是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮（flavone）结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态（苷元）的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方起着重要的作用。

【本人研究内容】

我做的是某中药的化学成分研究，该中药中主要为黄酮类成分，遵循传统用药原则，我采取水煎煮，之后水提液浓缩至一定体积，过大孔吸附树脂，乙醇水梯度洗脱，梯度：水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇。每个梯度做为一个流分，再进行细分。下一步主要是运用聚酰胺柱色谱，中低压ODS，Sephadex LH20进一步分离，最后制备液相得到单体化合物。

【经验分享】

主要和大家分享我使用聚酰胺柱的经验，我一般是聚酰胺薄膜结合聚酰胺柱，类似于硅胶板结合硅胶柱。所用的聚酰胺为30-60目，聚酰胺薄膜一盒50片，规格为8cm x 8cm，70块钱左右，可以根据需要剪成条状使用。聚酰胺薄膜常用的溶剂系统说明书上有，我常用甲醇-水，因为黄酮类化合物有一定的酸性，展开剂要加点酸，甲酸乙酸都可以，抑制其解离，保持游离状态的话，样品成点性好，否则拖尾很严重。在此需要指出的是，聚酰胺可以用反相溶剂系统，如甲醇水；也可以用正相溶剂系统，如二氯甲烷甲醇。要根据自己样品的极性来定。以我的80%乙醇洗脱物为例，进行详细的叙述。此部分极性较小。我用二氯甲烷溶解，拌样，挥干。洗脱系统为甲醇水，聚酰胺柱起始用水装柱，上样，上面要放一块棉花，然后用玻璃塞子压住（聚酰胺比较轻，防止加溶剂时冲起来），甲醇水梯度洗脱。之前点板显示，50%甲醇水刚刚展开一点，因此起始用50%甲醇水洗脱，然后梯度设为55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、最后甲醇冲柱。过程中每100mL一接，蒸干转移至小瓶。最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。
【部分聚酰胺薄层谱图展示】

左图：展开剂：（甲醇：水90：10）+2滴乙酸；
右图：展开剂：（甲醇：水80：10）+2滴乙酸，最右边的点为总样
显色剂为：三氯化铁乙醇溶液

【体会和教训】
黄酮类化合物用聚酰胺分离效果非常好，但是死吸附较严重，样品比较多时可以使用，少就算了。凝胶Sephadex LH20效果也非常好，建议多使用。黄酮类成分溶解性比较折磨人，但提醒一点在进行制备液相时，样品一定要用流动相溶解，或接近流动相，多加点总会溶解的，然后用0.45μm滤膜过滤。不用流动相溶解很容易把柱子弄裂分。原因在于，进样之后，样品析出，堵了柱塞板，导致局部流速过快，冲塌固定相。我就把老师的预柱整裂分了，多亏了预柱啊，保护了柱子，要不然老师肯定疯了，但是后来寄出去修预柱，别人检测又很神奇地自动好了，这有点解释不了，呵呵，这事也不是常能碰到的，最好按规矩来，否则耽误别人实验不太好。先就写这么多，实验也不是那么成功，但拿出来和大家交流，不对的地方请批评指正。
【样品导致预柱裂分的后果-色谱图展示】

左图为：样品制备时色谱图，当时已裂分
右图为：预柱用纯品检测色谱图，连续进样2针，可见预柱裂分严重。

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第1楼2010/09/19

很好很强大~
关于制备液相的时候，黄酮类用流动相溶解，我也有相同体会~
若不小心，容易造成液相压力升高，很烦人的~

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阿宝

第2楼2010/09/19

楼主加上个对比的图谱效果会更好
更直观

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第3楼2010/09/19

楼上的是说制备液相的裂分图吗？

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幽灵龙猫

第4楼2010/09/20

好的，我还要进行编辑，到时候上传图。
阿宝(lpr20) 发表:楼主加上个对比的图谱效果会更好
更直观

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第5楼2010/09/20

好，等你把谱图传上来，再给予奖励~

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baixi2010

第6楼2010/09/20

请问楼主，您用的大孔树脂和聚酰胺柱子是普通的色谱柱吧！如何达到控制流速的目的呢。我最近用130-200目的聚酰胺纯化黄酮，柱子的流速很慢

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liuliuhui

第7楼2010/09/20

总结得很详细，凝胶确实挺好用，楼主有可能的话一定要尝试一下

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elvisnoxug

第8楼2010/09/21

好帖，期待继续，继续，继续！

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elvisnoxug

第9楼2010/09/21

最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。

这个还不是很清楚。合并的是什么？
后面制备液相是聚酰胺的柱子吗？如果是，压力是多少？
如果不是，条件是统一的吗？

非常感谢！

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第10楼2010/09/21

合并的应该是聚酰胺柱的各流分吧~
后面制备液相是根据HPLC-DAD分析结果来决定的~
HPLC-DAD分析、还有制备，都是C18柱子吧~
xuxushug(xuxushug) 发表:最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。

这个还不是很清楚。合并的是什么？
后面制备液相是聚酰胺的柱子吗？如果是，压力是多少？
如果不是，条件是统一的吗？

非常感谢！

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