HPLC法测定桃红四物汤中苦杏仁苷和红花黄色素的含量
摘 要
目的：测定桃红四物汤水提液中苦杏仁苷和红花黄色素含量。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）测定桃红四物汤中苦杏仁苷和红花黄色素含量。苦杏仁苷色谱条件：流动相:甲醇-水(27∶73) ;色谱柱Hypersil BDS C18(4.6mm×200mm, 5µm)，柱温25 ℃，检测波长218 nm；红花黄色素色谱条件：流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（20∶80），色谱柱Hypersil BDS C18(4.6mm×200mm, 5µm)，柱温25℃，检测波长：403nm。流速均为1.0mL·min-1，进样量均为:20μL。结果:苦杏仁苷在0.0822～1.315mg·mL-1范围内线性关系很好（ r = 0.9998 ），平均回收率为98. 87 %，RSD为1.2%；红花黄色素在2.34×10-2～7.50×10-1 mg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9805），平均回收率为99.20%，RSD为0.88%。结论：本法简单快捷，重现性好，可作为桃红四物汤中苦杏仁苷和红花黄色素的质控方法。
关键词：桃红四物汤；苦杏仁苷；红花黄色素；高效液相色谱法
ABSTRACT
Objective:To determine amygdalin and safflor yellow（SY）in Taohong Siwu Decoction.Methods:amygdalin was analyzed by HPLC on a Hypersil BDS C18 column (4.6mm×200mm, 5µm)，and detected at 218nm. The mobile phase was methol-water (27:73) at a flow rate of 1.0mL•min-1. Safflor yellow was analyzed by HPLC on a Hypersil BDS C18 column(4.6mm×200mm, 5µm)， and detected at 403nm. The mobile phase was methol-0.1% H3PO4) (20:80) at a flow rate of 1.0mL•min-1. Results: The calibration curve was linear in the range of 0.0822～1.315μg·μL-1（r = 0.9998）for amygdalin and 2.34×10-2～7.50×10-1 μg·μL-1（r=0.9805）for safflor yellow. The average recoveries were 98.87% for amygdalin and 99.2% for safflor yellow .The RSD of the method were 1.2% and 0.88% respectively.Conclusion: The method was proved to be fast, feasible, simple, and can be used for quality control of amygdalin and safflor yellow in Taohong Siwu Decoction.
Key words: Taohong Siwu Decoction; amygdalin; safflor yellow; HPLC
前 言
桃红四物汤来源于清・吴谦等所著的《医宗金鉴》，由四物汤加桃仁、红花组成。“四物”养血活血，配以桃仁、红花进行破血行瘀。现代研究及实践表明，桃红四物汤具有抗血栓形成，能够加快血流，增加心肌流量，改善脑部血液循环，促进神经系统功能恢复，改善微循环，治疗皮肤病等多种功效[1-2]，是活血化瘀的代表处方之一。苦杏仁苷不仅能够镇咳平喘，抗凝血，而且具有良好的抗肿瘤作用，被用作治疗癌症的辅助药物[3]；红花黄色素具有清除自由基，降血压，保护心、脑血管等作用[4]。本实验用于测定其主要有效成分苦杏仁苷和红花黄色素的含量，结果表明本法准确、精密、重现性好，可以作为桃红四物汤中苦杏仁苷和红花黄色素的质控方法。
材料及方法
1 仪器和材料
1.1 仪器 HP1100型高效液相色谱仪及化学工作站（美国Agilent公司）；微量分析天平（TG-322A上海天平仪器厂）；分析天平（TG-328A，上海天平仪器厂）；CS66-2电热恒温干燥箱（长沙）。
1.2 材料 桃仁、红花、川芎、当归、白芍、熟地购于张家口第四医院，经河北北方学院姜希强老师鉴定。经去离子水漂洗（洗去浮尘与污物），于干燥箱中60℃干燥，按复方规定比例（桃仁9克、红花6克、熟地15克、当归12克、白芍10克、川芎9克）称量各单味药混匀，粉碎，置干燥器中备用。
1.3 试剂 苦杏仁苷(110820-200403)、红花黄色素(111637-200301)对照品(中国药品生物制品检定所)。所用其它试剂均为分析纯。
2 试验方法
2.1 色谱条件:苦杏仁苷色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18column (4.6mm×200mm,5µm),流动相:甲醇-水(27∶73);柱温25℃，检测波长218nm，流速1.0mL·min-1，进样量20µL。红花黄色素色谱条件[5]：色谱柱：Hypersil BDS C18(4.6mm×200mm,5µm)，流动相为甲醇：0.1%磷酸水溶液（20∶80），柱温25℃，检测波长：403nm，流速1.0mL·min-1，进样量：20µL。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取一定量的苦杏仁苷和红花黄色素的对照品，用甲醇水溶液制成标准储备液，得苦杏仁苷、红花黄色素对照品溶液浓度分别为2.630mg·mL-1、1.50mg·mL-1。
2.3 供试品溶液的制备 取复方药材粉末，用分析天平准确称取5份，质量分别为0.8905g,0.9464g,0.9025g,0.9931g,0.9753g，分别置于50ml比色管中，加入25ml蒸馏水，浸泡2h沸水浴40min。静置分离，吸取上清液，在残渣中继续加入25ml蒸馏水，沸水浴40min，静置吸取上清液，再次在残渣中各加入15ml蒸馏水，沸水浴30min，静置吸取上清液。合并三次提取液，定容至100.00ml备用。
2.4 标准曲线和线性关系 分别取苦杏仁苷和红花黄色素的标准贮备液(2.630mg·mL-1)适量，用流动相等比稀释调配（2、4、8、16、32）的系列对照品溶液,依2.1项方法，测定峰面积的积分值,以峰面积为纵坐标(A),对照品浓度(mg·mL-1) 为横坐标(c) ,绘制标准曲线,得回归方程。
2.5 样品含量测定 精密吸取上述供试品溶液，进样20μL，在上述色谱条件进行测定，代入回归方程，计算样品含量。
3 方法学考察
3.1 色谱系统适用性 在以上色谱条件下检测，得到苦杏仁苷的保留时间，红花黄色素的保留时间。结合峰面积计算各自理论塔板数。
3.2 精密度试验 取2.2项下同一对照品溶液,按上述色谱条件连续进样6 次,计算苦杏仁苷和红花黄色素的RSD值。
3.3 重复性试验 按2.3项下平行制备5份供试品,按上述色谱条件进行测定,计算苦杏仁苷和红花黄色素的RSD。
3.4 稳定性试验 取供试液,隔2h测一次,共测6次,考察样品的稳定性。
3.5 回收率试验 称取一定量的已测定含量的复方样品，分别加入一定量的苦杏仁苷、红花黄色素对照品溶液，按2.3项制备供试液，按2.1项测定, 并计算苦杏仁苷回收率、红花黄色素回收率。
结 果
1 色谱系统适用性 苦杏仁苷（见图1）保留时间8.035min,红花黄色素（见图2）保留时间9.355min,以保留时间和峰宽计算，苦杏仁苷理论塔板数9000，红花黄色素理论塔板数7000，复方在此条件下分离很好。
2 标准曲线和线性关系 苦杏仁苷标准曲线（见图3）.回归方程为A=2127c+6.112,r=0.9998,结果表明苦杏仁苷在0.0822～1.315mg·ml-1范围内线性关系很好。红花黄色素(图4)回归方程A=27064c+12.632，r=0.9805,表明红花黄色素在2.34×10-4～7.50×10-1mg·ml-1之间线性关系良好。
3 精密度试验 苦杏仁苷的RSD分别为1.8%，红花黄色素的RSD为0.63%（见表1），结果表明精密度良好。
4 重复性试验 苦杏仁苷和红花黄色素（见表2）的RSD分别3.8%、1.3%，结果表明重复性良好。
5 稳定性试验 结果表明（见表3）,供试液中苦杏仁苷在10h内稳定，红花黄色素在10h内稳定，RSD分别为1.8%，和1.4%。
6 回收率试验 结果表明，苦杏仁苷回收率(见表4)为98.87%,红花黄色素回收率(见表5)为99.20%，符合方法学要求。
7 样品含量测定结果 样品含量测定精密吸取上述供试品溶液，进样20μL，上述色谱条件进行测定，代入回归方程计算，结果见表6。
讨 论
1 苦杏仁苷的检测波长（218nm）的选择依据有关文献而得到，红花黄色素的检测波长（403nm）依据05年版药典而得到，在这两个波长处各得到相对高的检测灵敏度，且复方中无其他成分干扰。
2 苦杏仁苷根据文献依次采用一定比例的甲醇―水、乙睛―水或甲醇―乙睛―水为流动相, 可得到很好分离。结合多方原因，选用流动相为甲醇―水(27:73) 苦杏仁苷可达到最好分离，理论塔板数最高。
3红花黄色素的流动相的选择根据药典选用不同比例的甲醇―乙睛―0.7﹪磷酸溶液作流动相, 但结合液相色谱柱的酸碱耐受力，结果以甲醇：0.1%磷酸水溶液=20∶80，即可得到很好峰形, 且保留时间适宜。因此测定复方水提取液中红花黄色素的含量未采用药典方法。
4 本文采用HPLC法测定桃红四物汤水提液中苦杏仁苷和红花黄色素的含量,苦杏仁苷、红花黄色素与其它成分能够很好分离且保留时间短，该法操作简便、快速,可用于苦杏仁苷和红花黄色素的含量测定。
5 本文建立的检测桃红四物汤水提液中苦杏仁苷和红花黄色素含量的方法，可用于该复方的定量分析。同时,本研究也可为进一步探讨该方的药理学和药代动力学提供实验基础,具有一定的重要意义。
6 有文献报道苦杏仁苷和红花黄色素提取温度过高、时间过长容易分解 ,本研究未对提取的浸泡时间,水浴温度和时间进行考察, 因此最终确定的最佳提取条件仍需进一步考察。
结 论
1 本实验以水为溶剂提取桃红四物汤中红花黄色素和苦杏仁苷，具有溶剂无毒、廉价的优点。
2 本实验以红花黄色素和苦杏仁苷为对照品，采用高效液相法测定桃红四物汤中二者含量，简单快捷，重现性好，可作为桃红四物汤中苦杏仁苷和红花黄色素的质控方法。
参考文献
[1] 张民庆.中医临床方剂学[M].北京：人民卫生出版社.2004.336
[2] 阴健.中药现代研究与临床应用(Ⅱ) [M].北京:学苑出版社,1994. 291.
[3] 邢国秀,李楠,杨美燕,等. 天然苦杏仁苷的研究进展[J].中成药,2003,25(12):1007~1009.
[4] Xie Ming-yong,WANG Hui-qin,NIE Shao-ping.Study on Antioxidant Activities of Safflower Florets[J].Food Science,2006,27(9):36-40.
[5] 杨日丽,刘静. 川红片中红花黄色素与阿魏酸的HPLC检测方法[J]. 中药材，2007，30(11):1474-1475.
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