【资料】高速逆流色谱

高速逆流色谱(high speed countercurrentchromatography，简称HSCCC)是一种液-液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化学、有机合成、环境分析等领域。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家。张天佑等在国内首先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪，对我国中药功能成分的分离制备取得了显著成果。上海同田生化技术有限公司生产的高速逆流色谱仪，分离中药成分纯度达到99%，可用于HPLC检测标准样。 　　高速逆流色谱 （ high-speed countercurrent chromatography ， HSCCC ）是 20 世纪 80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术， 它不用任何固态的支撑物或载体。 它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。

由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段。 　　它相对于传统的固—液柱色谱技术，具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前 HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域， 特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技 术；适合于中小分子类物质的分离纯化。 　　我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家，俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国 FDA 及世界卫生组织（ WHO ）都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定， 90 年代以来，高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。

原理　　1.　逆流色谱是20世纪50年代源于多极萃取技术（非连续性）

　　
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多极萃取技术(请点击查看大图)

但是多极萃取设备庞大复杂、易碎、溶剂体系容易乳化，溶剂耗量大，分离时间长。

　　2. 通过公转、自转（同步行星式运动）产生的二维力场，保留两相中的其中一相作为固定相

　　
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高速逆流色谱原理(请点击查看大图)

2.通过高速旋转提高两相溶剂的萃取频率，1000rpm旋转时可达到17次/s频率的萃取过程。

　　
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高速逆流色谱原理2(请点击查看大图)

　　3.HSCCC分离流程图

　　
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HSCCC分离流程图(请点击查看大图)

发展史　　1.　20世纪70年代，出现了液滴逆流色谱（DCCC）

　　特点：（1）流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES）

　　（2）分离时间过长、连接处容易出现渗漏等

　　2.20世纪70年代出现了离心分配色谱仪（Centrifugal partition chromatography，CPC）

　　
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离心分配色谱(请点击查看大图)

特点： （1）基于流体静力学原理（Hydrostatic equilibrium system，HSES），利用公转产生的单一力场

　　（2） 连接处较多而且容易出现渗漏，清洗维护复杂

　　3．20世纪80年开始出现了现在的高速逆流色谱，可称为最先进的逆流色谱

　　特点：（1） 基于流体动力学原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）

　　
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流体动力学原理(请点击查看大图)

应用领域
　　（ 1 ）天然产物已知有效成分的分离纯化 　　（ 2 ）化学合成物质的分离纯化 　　（ 3 ）中药一类、五类新药的开发 　　（ 4 ）中药指纹图谱和质量控制研究 　　（ 5 ）抗生素的分离纯化 　　（ 6 ）天然产物未知有效成分的分离纯化（新化合物开发） 　　（ 7 ）海洋生物活性成分的分离纯化 　　（ 8 ）放射性同位素分离 　　（ 9 ）多肽和蛋白质等生物大分子分离以及手性分离等

色谱仪构造　　仪器的中心部分：(a) ITO多层线圈分离柱，它是由100-200米长、内径为1.6mm左右的聚四氟乙烯管沿具有适当内径的内轴共绕十多层而成，其管内总体积可达300mL左右。(b)平衡器，它可以调节重量，它的作用是让(a)， (b)相对于中心轴两边重量平衡。当在旋转控制器的控制下，在齿轮传动装置作用下，(a)，(b)同时绕中心轴作顺时针或反时针的行星运动，即(a)- (b)本身既在自转，但同时又在绕中心轴公转，公转转速可从0-4000r/min。从线圈分离柱中通过中空的中心轴还同时牵引出了线圈的两端，一端供泵入液用，一端输出液体。仪器工作需要互不相溶的两种液体，一相作固定相，

　　一相作移动相。仪器工作前，先将作为固定相一相的液体通过恒流泵压入线圈分离柱，然后用进样器将待分离的样品按如图所示进样，最后用恒流泵压入移动相，同时启动中心部分运转直到转速大于600r/min。此时，两相在线圈分离柱中具有相对运动之势。由于移动相源源不断的压入，阻止了固定相的流出，同时，移动相带着样品在线圈分离柱中进行无限次的分配而使复杂样品得到分离。当移动相经过检测器时，由于不同的样品组分会产生不同大小的信号，用记录仪就能得到逆流色谱图谱，同时用馏分收集器分步收集移动相就会得到复杂样品被分开的组分。较大的制备型HSCCC，柱容积可达530m1，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC柱容积为8m1，进样量为几十微克，最大转速可达4000r/min，分析能力堪与HPLC相媲美。

特点

应用范围广，适应性好

　　由于溶剂系统的组成及配比可以是无限多的，因而从理论上讲可以适用于任何极性范围内样品的分离，在分离天然化合物方面具有其独到之处。由于聚四氟乙烯管中的固定相为液体不需要固相载体，因而可以消除固-液色谱中由于使用固相载体而带来的吸附损失，特别适用于分离极性物质。

操作简便，容易掌握

　　仪器操作简单，对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行的制备分离或分析。

回收率高

　　不需要固相载体，消除了由于样品在固相载体上的不可逆吸附和降解造成的损失，理论上样品的回收率可达。在实验中只要调整好分离条件，一般都有很高的回收率。

重现性好

　　如果样品不具有较强的表面活性作用，酸碱性也不强，即使多次进样，其分离过程都保持很稳定，而且重现性相当好。

分离效率高，分离量较大

　　由于其与一般的色谱分离方式不同，能实现梯度洗脱和反相洗脱，亦能进行重复进样，使其特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大

分配系数　　溶剂系统的选择是同时选择色谱分离过程的两相，是对样品成功分离的关键所在，而样品中各组分的分配系数决定着这种溶剂系统是否合适，因此分配系数的测定是选择溶剂系统的重要环节。目前，分配系数的测定多采用薄层色谱法、毛细管电泳法、HPLC法、生物活性分配比率法及分析型HSCCC法。

溶剂体系和溶液系统　　高速逆流色谱常用基本溶剂体系表

　　

　　上表中是根据被分离物质的极性列出一些基本的可供参考的溶剂体系，它包括非水体系和含水体系。

　　溶剂系统的选择对于HSCCC分离十分关键。遗憾的是到目前为止溶剂系统的选择还没有充分的理论依据，而是根据实际积累的丰富经验来选择。通常来说，溶剂系统应该满足以下要求：溶剂系统不会造成样品的分解或变性样品中各组分在溶剂系统中有合适的分配系数，一般认为分配系数在0.2-5的范围内是较为合适的，并且各组分的分配系数值要有足够的差异，分离因子最好大于或等于1.5；溶剂系统不会干扰样品的检测；为了保证固定相的保留率不低于50%，溶剂系统的分层时间不超过30秒；上下两相的体积比合适，以免浪费溶剂；尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理尽量避免使用毒性大的溶剂。根据溶剂系统的极性，可以分为弱极性、中等极性和强极性三类。经典的溶剂系统有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等。在实验中，应根据实际情况，总结分析并参照相关的专著及文献，从所需分离的物质的类别出发去寻找相似的分离实例，选择极性适合的溶剂系统，调节各种溶剂的相对比例，测定目标组分的分配系数，最终选择合适的溶剂系统。