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【第三届原创大赛】举例讲解——色谱缓冲体系pH的选定

省部重点实验室

2010/12/19

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原创：举例讲解色谱缓冲体系pH的选定

写在前面——反相色谱法：

一般用非极性固定相（如C₁₈、C₈）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

选择缓冲液正确的pH值，缓冲体系pH值的选择在反相高效液相色谱分析中，对可离解的化合物分析的重现性十分重要，不恰当的pH值可能导致出现不对称峰、宽峰、分裂峰或肩峰，而尖锐的、对称的峰是定量、定性分析中获得低的检测限，是两次甚至多次分析之间较低的相对标准偏差(RSD)和保留时间的高重现性的前提。我们将讨论在使用缓冲液时如何选择缓冲液的pH值，以及如何选择正确的缓冲体系。
　　

什么时候需要缓冲溶液?
　　随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但值得注意的是，C₁₈和C₈使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka在1-11之间，选择正确的缓冲液PH值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。
　　

如何选择缓冲液PH值？
　　在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液 PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。
　　如果选择不到合适的，样品的pKa与流动相的pH非常接近，那么流动相pH微小的变化，都会引起样品保留时间较大的变动。

举例：检测大肠杆菌发酵液中有机酸（主要为乙酸）

流动相的选择依据，流动相的pH值的主要取决于被分离的有机酸的pKa值，乙酸的解离常数是4.76，所用柱子能承受的最低pH值是2，在酸性流动相环境中，如果允许乙酸有1%的离子状态存在，则可预测流动相的pH值。

pH = pKa + Log [Ac^-]/[HAc] = 4.76 + Log 1% = 2.76

由上式可知，流动相的pH值应该是pH 2~2.76之间。配制pH=2.2，2.4，2.6，2.8四种梯度流动相，最后选择pH=2.2的流动相。pH值越小，酸的解离越少，峰形越好。反相C₁₈柱的容许pH范围2.0～8.0，而且磷酸盐在2.1处缓冲容量最大（由于篇幅所限，液相条件探索的色谱图省略处理）。

但是，当化合物只有氨基时，那就十分简单了，大多数氨基化合物pH值小于9时都被质子化，所以所有pH值在7或更低的溶液均适合应用。你也许会问水的 PH值大约是7，为什么还用缓冲盐？因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为pH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好.

应用缓冲液PH值来调节方法选择性?
　　如前面提到的，氨基化合物的保留值随pH的减小而降低，这个特性可以用来调节方法的选择性，如果两个化合物共流出，一个含有氨基，适当改变pH值就可以用来分离这一物质对。由于可离解化合物的选择性依靠pH值，所以变化pH值也可以用来鉴别未知化合物的官能团，如果pH值变小，出峰便快，则化合物中可能存在氨基，当pH变大,化合物出峰很快，或流出在死时间处，化合物可能是一种羧酸，因为羧基离子化后流出大大快于比质子化的中性化合物。
　　

小结：
　
正确选择缓冲溶液及其pH，在反相液相色谱方法中对于优化尖峰、检出限、以及获得稳定的保留时间等都十分重要，如果知道化合物官能团信息和化合物的Pka值，那么这一过程将变得十分简单。

从摇瓶、发酵有机酸图谱中我们可以看出这七种有机酸得到很好的分离效果，但发酵罐发酵干扰物质比较多，在样品萃取后干扰峰仍然比较多，但几种主要酸的峰分离效果较好（乙酸、柠檬酸、丙酸等）

分
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第1楼2010/12/19

补充：怎样为离子对试剂选择缓冲液

　　为应用离子对试剂的方法选择缓冲液的过程是相似的，离子对试剂例如四丁基铵的盐，十四烷基磺酸钠等，在流动相中可与化合物中可离解的官能团配对，在缓冲液中以离子形式存在的化合物就需要应用离子对试剂。

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省部重点实验室

第2楼2010/12/19

再补充：

在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log([A-]/[A])得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由HH公示得知，当溶液PH值等于 2.2时，99%的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱

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省部重点实验室

第3楼2010/12/19

流动相的pH值
　　采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
　　注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂。

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sunmei

第4楼2010/12/19

楼主的讲解对缓冲溶液的选择有很大帮助，学习了！

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青林

第5楼2010/12/25

选择缓冲液PH值如果没有常数,可以用"三倍原则"反推

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小卢

第6楼2010/12/26

如果实验中出现问题，比照着这些理论应该可以推断出点结论的！

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杰帝贝柯化工产品

第7楼2010/12/28

写得很不错，支持下

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yuduoling

第8楼2010/12/28

不错的原创作品，支持了。

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babyfast

第9楼2010/12/28

讲的很好呀，我有的时候就是头痛怎么选择PH值

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nbwqj

第10楼2010/12/30

楼主分析的不错,值得参考

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