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第1楼2010/12/30
第二步选择色谱柱。手边有两个厂家的色谱柱,一个是安捷伦公司的,一个是月旭公司的。月旭公司的色谱柱我们也已经使用了有一年多的时间,从质量到售后表现都不错,还是先试试他们的色谱柱吧。这次用两根月旭的色谱柱进行了调试和比对,从分离效果看都还不错。正因为在相同条件下分离效果都不错,从而在最终选择哪根色谱柱花了很大的精力。
色谱柱的型号分别为①:AQ-C18;5um,4.6*250mm ②:XB-C18;3um,4.6*150mm
第三步溶剂的选择。A产品对有机溶剂的溶解性都比较大,但它其中的一个杂质对有机溶剂却有选择,在甲醇中很难溶,在乙腈中的溶解性要强于甲醇,因此有机溶剂选择了乙腈,另一个溶剂就是水了,样品偏酸性,因此增加0.1%磷酸或者三氟乙酸以矫正样品的峰型。
以下是详细的操作过程:
一、仪器及设备
液相色谱:agilent,HPLC1200;
检测器:VWD;
柱温箱:30℃;
色谱柱:月旭色谱柱:①AQ-C18;5um,4.6*250mm;②XB-C18;3um,4.6*150mm
电子天平:梅特勒BS-220;
二、试剂
乙腈(色谱纯);
纯化水;
磷酸(色谱纯)
三氟乙酸(优级纯)
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第2楼2010/12/30
三、过程
因为考虑到手边刚好有空闲的两个月旭色谱柱,为了节约时间和更好的开发方法,从而选择在相同条件下分别用两根色谱柱进行分离,在选择了流动相比例的同时可以基本确定其中的一根色谱柱。同时需要说明的是,这次调试是针对A产品进行探索的,对于杂质没有特意关注,后期只需进行杂质定性即可。
首先流动相选用的是:0.1%的磷酸/乙腈=50/50,在色谱柱平衡稳定后注射样品进行检测,下图是截取两个色谱柱分析后的谱图进行对照。从峰型上看两者不分上下,都比较尖锐,但细看感觉XB-C18稍微有点拖尾。从保留时间上看,XB比AQ更加理想,比较适中。
下图是二者的一些相关系数比较。分别用红线标注。
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第6楼2010/12/30
从以上调试的情况看,两种色谱柱在合适的条件下都能达到很好的峰型和塔板数,但这二者只能选择其一,XB-C18在总体来看或多或少有点拖尾的感觉,不如AQ-C18的峰型漂亮,还有一个原因是因为XB-C18由于粒径比较小,仪器的泵压比较高,最高的达到了127bar的压力,而AQ-C18色谱柱的最高压力为100bar,因此在色谱柱选择上投了AQ-C18色谱柱一票。色谱柱选择后,对于流动相的选择就比较简单了,综合考虑后初步选择了40/60这个比例。
当然这是在样品纯度比较高的情况下进行的初步选择,也可能在日后的实际运行过程中会出现很多不合理的现象,这些都是需要在出现问题后才可以针对性的进行调整。经过这一个多月的试运行,也确实发现很多需要改进的地方,由于时间的限制,目前还在进一步的优化过程中,再经过一段时间的调整和优化,待方法成熟后会整理出一个详细的方法与大家共享。