植物药分析中的薄层色谱-全文,转载

1、前言

传统薄层色谱法被广泛应用于药用植物的分析中，并作为植物药鉴别方法被世界上多数药典收录。薄层色谱一般方法学的描述通常并不详细，并给操作者留有太多的空间。因此用这种方法所得到的结果很值得考虑，有时甚至会难以判断。由于在薄层色谱中影响结果的许多参数被忽视，薄层色谱结果的重现性常常不能令人满意。这是阻碍任何方法现代化的巨大阻力。因此，出现了这样一种论调，认为薄层色谱是一种陈旧过时的技术，应该用更可靠的高效液相色谱或其它色谱技术代替它。

但是大家不应忽视薄层色谱具有众多的优点。无论在植物药的鉴别，提取物和最后产品的稳定性测试，还是在生产过程中的进程控制，薄层色谱可将结果用一个图片表现出来的这个优点不可替代。快速的分析和每个样品分析的低成本也是它的优点。

一个应用于新的药典各论的现代标准方法是让大家认识和接受薄层色谱是具有竞争力的现代分析方法的基本要求。这篇文章讨论了薄层的基本要素和实际工作中的要求，达到了这个最基本的目标。希望能促进这个建设性议题的讨论。

2、薄层色谱在药典中的现状

在欧洲药典中，薄层色谱在所有的植物药、大多数提取物以及一些合成药物的各论中作为鉴别的基本手段。对于合成药物来说，似乎有一种趋势，在新增或修订的各论中不再使用薄层色谱作为有关物质检查的方法。

虽然与其它药典相比，欧洲药典在薄层色谱的一般方法学部分具有较高的水平，但是仍没有反映在方法学方面的一些技巧以及当前技术所带来的好处。虽然规定只能使用预制薄层板，但是没有明确普通薄层板和高效薄层板之间的差别，也未说明哪种薄层板是首选。缺少薄层色谱一些重要实验细节（如薄层点样、薄层展开和衍生化）的指导性原则，甚至没有提到通过图象分析进行定性分析这一薄层最重要的优点。虽然在一般方法学部分提到薄层色谱可作为定量方法，但是只有两个品种使用薄层色谱进行定量。所有的含量测定都使用高效液相色谱，甚至在鉴别中薄层色谱也被成功地用其它技术替代。如果采用现代薄层色谱技术，可以很容易地改变这种状况。

3、关于方法学改进的建议

3.1薄层板的材料和特性

在70年代末期，Merck研制出了高效薄层板。它具有更小的粒度(5μm)和更窄的粒度分布范围(2-10μm)。与传统薄层板相比，高效薄层板具有更好的均一性，更平整的表面和更高的分离性能。表1比较了两者的差别。（略）

假设药典原来用普通薄层板的方法以高效薄层板替代。我们就可以得到具有更好分离度，更少斑点扩散以及更好的板间重现性的结果。瑞士植物化学专业委员会已经在几个方法中确认了这个设想，并在欧洲药典注释中出版。例如，图1比较了苦橘油和甜橘油在两中薄层板上的分离情况。可以得出结论高效薄层板是最好的也是最经济的选择。

虽然在各论中不能规定商品的品牌，但是也应引起注意，不同的生产厂家生产的薄层板即使通过了药典试剂章节要求的系统适应性试验，也会明显地影响到某一特定方法结果所得的重现性。（图2）

因为很难设计一个实验对薄层板分离可能碰到的所有问题进行评价，在进行方法描述时应对薄层板的生产厂家进行规定，或者在方法中包含一个专门的效能测定实验（系统适应性实验）。这些工作已经要求作为各论的详细技术指导在研究方法时考察并提交给药典。然而似乎并没有规定在完成各论前的方法学考察中实际包含两种材料的薄层板，在方法的确认时也没有考察不同的薄层板材料，除非这些工作已经包含在各论中。这些都应该有一个大家可以接受的法定的要求。

3.2薄层点样

薄层鉴别都是基于比较薄层比移值（Rf值）。因此分析的质量依赖于样品的正确定位。在定量分析中，点样体积也应规定并可重现。此外，分离质量还取决于点样原点的大小、形状以及斑点均一性。

将溶液中的样品转移到薄层板上有接触式和喷雾式两种点样方法。在点状点样时，样品溶液形成“环状色谱”，导致样品在点样原点上的不均匀分布。在展开后，斑点可能展宽或不均匀。当样品溶解于对其溶解性很强的溶剂中时，这种现象更为严重。

采用喷雾点样方式可显著提高薄层系统的分离度和检出限。它也可将浓度低的样品以大体积点于薄层板上，同时不影响分离的质量。

样品条带状点样，便于色谱的目视。如果这些条带是通过喷雾产生的，在整个条带上的样品的均一性又可得到进一步的提高。这是得到可靠的和可重复的定量分析结果的基础。应该注意，用一个接一个的小点点样所形成的条带或用所谓的浓缩带原点并不能得到那样好的分离度，其比移值小的斑点会受到干扰。（图3B-D）

3.3展开

薄层色谱的结果（斑点的位置、形状和分离度）依赖于展开缸的类型和饱和程度，如图4所示。因此一个方法只在特定的展开缸中以特定的方式展开才可具有重现性，如不进行调整，在其它系统中很难得到相同的结果。相关的理论我们在其它文章中有详细说明。虽然常常使斑点较未饱和或双槽展开缸扩散大，但经典的饱和步骤（在展开缸或水平展开槽中）可获得最好的重现性。

在薄层色谱的展开过程中，展开剂的移动速度不断减小（如图5）。因为采用更小的粒子使薄层板更为紧密从而阻碍了展开剂的运动，高效薄层色谱板只能展开很短的距离。

在一个固定的展开槽中，固定其它参数不变，两个成分的分离度不单取决于它们在薄层色谱中的相对位置（比移值），还与溶剂前沿的移动位置（展开距离）有关。

图6是两个成分在高效薄层板上的分离度与展开距离之间的关系图，其中假定选择因子（α）为1.5。分离度用公式 Rs=(α-1)(RfN)1/2(1-Rf)/4。 在高效薄层色谱中，当展开距离为5-7cm时可得到最好的分离度，在展开距离为6cm时可得到最大的分离度。在硅胶板上，大多数展开剂需要7-20min展开。在一特定的色谱分离中，比移值应在0.3-0.4最佳。应调整溶剂的比例，使主要成分的位置在此范围之间。

这些理论的推测可以很容易地用实验验证。在图7中是甘菊油的高效硅胶薄层分离结果。当展开距离增加时，在图7A中比移值0.4-0.5（箭头所示）的两个斑点的分离度似乎有所增加。但是如果把这些色谱图放大到同一个刻度，两个斑点的相对位置似乎没有变化。分离度仍然在展开距离为6cm时最大。一般来说，随着展开距离的增大，比移值减小。这种现象可能是由于展开剂中的挥发性成分在薄层板上逐渐增加的所引起。同样刻度的相似曲线图也可得出与薄层图相似的结果。

3.4衍生化

不用很复杂的操作就可用化学衍生将薄层转变成可见的色谱结果或提高检出度。多数常见的衍生化试剂配成溶液使用。将展开过的薄层板喷上或浸入上述溶液。虽然在各论中多采用喷雾法，但是除非使用专门的设备，喷雾显色很难标准化。喷雾显色需要很好的技巧。喷到薄层板上的溶剂量，以及在薄层板上的均匀程度很难在方法中精确地描述。这使这个步骤几乎不可能完全重现。喷雾显色的另外一个缺点就是会产生有毒气体。

浸板显色法相对容易操作和控制。显色剂的浓度和浸入的时间、速度等都可以设定从而得到可重现的结果。薄层板上的溶剂也很均匀，保证了定量分析结果的正确性。在浸板过程中也不会产生溶剂气体。一般化学衍生都包含加热步骤，这些都应在方法中精确地描述。“在某一特定温度加热××分钟或至颜色出现”并不足以确保结果的重现。

显然，在一般方法学部分不能将衍生化规定得太详细，但是在各论中应将衍生化的步骤精确定义。应该细化的参数包含在衍生化前如何处理展开后的薄层板，在浸板后薄层板的干燥条件，如果需要加热还应包含加热前和加热后的等待时间。图8是金丝桃提取物在高效薄层板上用天然产物试剂/聚乙二醇衍生化时在不同衍生化方法下的结果。

3.5记录

薄层色谱的一个独特的优点，并使该方法与其它色谱方法相区别的就是薄层色谱可以得到一个图片以反映和表达色谱的结果。现在可以使用摄相机、数码相机甚至电脑扫描仪将薄层色谱转变为电子图象。

在现行药典中针对薄层色谱的描述并没有将结果完全、详细和客观地表达出来。例如在欧洲药典中所描述的茴香油（也包含八角茴香油）的鉴别实验结果。在紫外254nm下，样品显示两个斑点分别对应于茴香醛和大茴香醚（茴香脑）。在用香草醛显色后，样品显示对应于芳樟醇和大茴香醚的斑点，它们是接近于溶剂前沿的紫红色斑点。此外Pimpinella anisum 可能在茴香醛斑点上显示一个棕色斑点。

表2 药典茴香油鉴别实验结果描述表（其它斑点将口头描述）



薄层板顶端
薄层板顶端

大茴香醚：一个淬灭斑点
一个淬灭斑点（大茴香醚）

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茴香醛：一个淬灭斑点
一个淬灭斑点（茴香醛）

——
——

对照溶液
样品溶液




薄层板顶端
薄层板顶端


一个紫色斑点（单萜烃类）

大茴香醚：一个橙色－粉色斑点
一个橙色－粉色斑点（大茴香醚）

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——

芳樟醇：一个蓝色斑点
一个蓝色斑点（芳樟醇）

对照溶液
样品溶液




欧洲药典用表格来体现薄层结果（表2），可以更好地表达相对位置，较原来有所进步。但是并不能完全替代薄层图的作用，如图9所示。

很明显，在这个例子中，口头表达或表格描述均不能完全表达两种油的薄层结果。在图谱中标有黄色箭头的斑点均未提及，也未认可“其它”斑点的出现。然而更重要的问题是，是否这些样品可以通过药典茴香或八角茴香油的鉴别实验。薄层图表明，这两个油有明显的差别并很容易区别。（注意：现在药典中的茴香和八角茴香油的各论正在修订中）

和其它薄层步骤一样，采用电子记录设备进行薄层记录时所有的参数必须精确地界定并实施以确保结果的重现性。可以预测，在不久的将来，薄层色谱的电子图象将成为图谱的基础，并将成为药典植物药各论的实用附录。如果不仅仅提供该植物的一张指纹图谱，而是收录多种检测下的薄层的图片，这将是该图谱的一个独特优点。此外可通过在同一块薄层板上分析几批有代表性的样品来考察每一种植物的自然差别。还可将常见替代品的指纹图谱收录其中。

3.6标准化和国际协调

在以上部分中，我们讨论了薄层色谱各步骤中的几个重要参数，并对欧洲药典通则和各论项下的改进提出了建议。然而应该引起注意的是，提供一个适宜的框架并不足以实现现代薄层色谱的所有潜能。应同时采用新的标准化的方法学表述。这些表达应类似于SOP，可包含于各论的详细技术指导中。在图10中的例子说明了这个问题。实验室A建立了一个高效薄层色谱鉴别当归Angelica sinensis和欧当归Levisticum officinale的方法，他们把这个方法用文字记录下来并交给了实验室B进行复核。两个实验室都认为他们完全按照方法进行了操作，所得到的结果虽然相似，但并不是完全相同。以下详细比较了两个实验室的操作上的不同，虽然他们都认为“采用了正确方法进行实验”。

图10 两个实验室归Angelica sinensis和欧当归Levisticum officinale高效薄层色谱鉴别



实验细节
实验室A
实验室B

展开剂
甲酸：乙酸乙酯：甲苯 （10：10：90 V/V）

预洗
无
甲醇-氯仿（105℃下干燥30分钟）

饱和情况
20分钟（滤纸）
15分钟（没有滤纸）

衍生化方法
浸板
喷雾

记录
摄像，反射+透射
电脑扫描仪扫描

薄层板活化
在实验室中平衡（相对湿度40%）
P2O5干燥一夜，相对湿度未知




图11是金花菊（Echineacea spp）的高效薄层色谱鉴别结果。这个实验严格按照标准方法操作。这个方法按照AOAC同等验证方法程序指导原则进行过确认。两个实验室在不同的时间均得到了几乎相同的结果。这个方法已经上交欧洲药典注释（狭叶金花菊根，白色金花菊根，和紫色金花菊根）。

4、结论

基于理论和实践考虑，有必要对欧洲药典中关于薄层色谱一般方法学部分进行审议。在新增和修订药用植物各论时应包含有采用现代标准化方法学的薄层色谱鉴别。主要需考虑以下因素：

（1）薄层色谱方法一般应采用高效薄层板。

（2）为得到最好的定性定量分析结果，样品应采用喷雾点样，样品点应呈条带状。

（3）建议一般展开高效薄层板先预饱和，展开距离超过6cm。

（4）采用颜色反应以得到可见的薄层色谱结果的，应详细描述衍生化步骤。

（5）除采用描述方法外，还应用彩色图片以图籍的方式提供薄层结果。多个图象（如在紫外254nm，紫外366nm，可见光下的图象）有利于分析结果的判断。也应考虑为产品提供对照物质。

薄层色谱方法学的标准化是分析结果可比性的基本要求。

全文转载,希望对大家有所裨益.

我想有没有制药行业的同行也用这种方法的？

谢谢 提供

谢谢楼猪,行苦了!

谢谢，很有用，