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【资料】衍生手性物质实现反相拆分新技术

cyey_myq

2011/04/16

实验室认可/资质认定

衍生手性物质实现反相拆分新技术

一种用液相色谱法分离测定奈必洛尔杂质的方法
在药物分析中色谱技术和光谱技术已基本普及，近年来色谱法和光谱法的联用技术在药物分析中被日益广泛应用.本文拟对用于药物分析的现代分析技术作简单介绍，以便有关研究工作者作参考.
1 现代色谱法
1.1 手性药物的液相色谱分析法上世纪80 年代初，随着大量商品化HPLC 用手性固定相的问世以及对手性识别机理的较深入的认识，HPLC法已迅速成为广泛应用于分离和测定药物对映体的方法.
手性HPLC拆分法分类：
由于D-型和L-型对映体的物理性质完全相同，难以在普通固定相上分离，只能在手性固定相上才能获得拆分；如果利用对映体分子中的反应基团与某一光学纯试剂反应形成了非对映光学异构体混合物，其物理性质就有较大的差异，因而在普通固定相上实现分离.因此，手性HPLC 拆分法通常分为直接法和间接法两大类.对映体混合物以手性试剂作柱前衍生，形成非对映体异构体对，然后以常规固定相分离，称为间接法，也称手性衍生试剂法；未作上述处理，使用手性流动相或手性固定相拆分者即是直接法.其共同特点是，均以现代HPLC 技术为基础，并引入不对称中心；不同的是间接法是将其引入分子内，而手性固定相和手性流动相则引入分子间.引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异是手性HPLC进行光学异构体拆分的基础.

本发明公开了一种用液相色谱法分离测定奈必洛尔杂质的方法，以纤维素三（３，５－二甲苯基氨基甲酸酯）即OD-H柱为填料的手性色谱柱，以缓冲盐溶液与有机相按一定配比组成的混合溶液为流动相，该方法能快速准确地分离和测定这两种光学异构体。

建立了在碱性条件下从水相中用乙酸乙酯提取阿替洛尔，用GITC进行柱前手性衍生化，以及用流动相NaH2PO4缓冲液-CH3OH-CH3CN(50∶20∶30）在ODS柱上拆分的分析方法，254 nm波长处检测。

前言：本文用乙酰葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)作柱前手性衍生化试剂,反相高效液相色谱法拆分氨基酸立体异构体。研究了不同构型氨基酸与GITC反应后所生成的衍生物的紫外吸收响应特点。探讨了16种氨基酸GITC衍生物的色谱分离情况。

采用ZORBAX-C8(150 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,在流动相为甲醇-0.05 mol.L-1磷酸二氢钾溶液(40:60,pH6.0)、紫外检测波长为254 nm、流速为1.5 m.lmin-1、柱温35℃的色谱条件下,巴氯芬对映体衍生物获得了基线分离,分离度为1.93,并确认了R(+)-衍生物的色谱峰

摘要　目的：建立阿替洛尔两对映体在鼠肝微粒体中的RP-HPLC测定方法。方法：从鼠肝微粒体中提取阿替洛尔消旋体，采用手性衍生化试剂2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)对阿替洛尔消旋体进行柱前手性衍生化再以RP-HPLC拆分，测定鼠肝微粒体中阿替洛尔各对映体含量。结果：建立了在碱性条件下从水相中用乙酸乙酯提取阿替洛尔，用GITC进行柱前手性衍生化，以及用流动相NaH2PO4缓冲液-CH3OH-CH3CN(50∶20∶30）在ODS柱上拆分的分析方法，254 nm波长处检测。阿替洛尔对映体在1～20 μg.mL-1范围内呈良好线性关系，S(-)-阿替洛尔：Y=840　076.5X+141 742.8，r=0.999 8；R(+)-阿替洛尔：Y=873 157.2X+192 187.5，r=0.999 8)，LOD为55 ng.mL-1，LOQ为145 ng.mL-1（RSD<7%），相对回收率在95％～105%（RSD<5%）。用此方法试验了阿替洛尔在鼠肝微粒体中的代谢测定。结论：结果表明此方法可用于研究阿替洛尔消旋体在鼠肝微粒体中代谢和酶动力学研究。
关键词　阿替洛尔　2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)　鼠肝微粒体　高效液相色谱法　手性衍生化

　　阿替洛尔（atenolol，（+）-4-［2-hydroxy-3-［（1-methylethyl）-amino］ propoxy］ benzeneacetamide，图1-A）作为一种β-受体阻断药，能与去甲肾上腺素能神经递质或肾上腺素受体激动剂竞争β-受体，从而拮抗其β型拟肾上腺素作用，临床上常用于治疗心绞痛和高血压，通常以消旋体给药，但阿替洛尔S（-）-对映体的β-受体阻断作用比R（+）-对映体强［1］。所以R（+），S（-）-阿替洛尔的手性拆分在药效学和药动学的研究中都具有重要意义。关于阿替洛尔的测定，文献报道多为阿替洛尔消旋体的测定方法，如薄层色谱法［2］、气相色谱法［3］以及用紫外和荧光检测器的HPLC法［4～7］。在手性衍生化法拆分方面Chin SK、Rosseel MT等建立了以S-（-）-β-甲苄基异氰酸酯、(+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯为手性衍生化试剂的RP-HPLC法［8～10］，测定阿替洛尔在血和尿中的对映体含量。

图1　结构式
A.阿替洛尔　B.GITC

　　为研究手性药物的代谢机制，需要运用手性分离手段［11～13］。本文应用2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocynate，GITC，图1-B)为手性衍生化试剂与阿替洛尔消旋体反应生成非对映衍生物，用RP-HPLC法实现了分离，并建立了阿替洛尔消旋体在鼠肝微粒体中的对映体测定方法。用此方法观察了阿替洛尔在鼠肝微粒体中的代谢情况。
1　仪器与试剂
　　日本Shimadzu LC-10ATvp泵、SPD10Avp紫外检测器。
　　还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、GITC、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)均购自美国Sigma公司，阿替洛尔购自中国药品生物制品检定所。
　　实验中所用试剂均为分析纯试剂。
　　NaH2PO4缓冲液：精密称取NaH2PO4.2 H2O 0.780 1 g，精确加入水500.0 mL，混匀后用5 μm孔径的滤膜过滤，即得（10 mmol.L-1，pH=4.64）。
2　手性衍生化方法
　　在0.5 mL含阿替洛尔的微粒体孵育液(由“9”项获得)中，加氯化钠0.2 g及浓氨水50 μL，旋涡振荡30 s，加乙酸乙酯3.00 mL，再旋涡振荡2 min，3 000 r.min-1 5 min，精密移取有机层2.80 mL至另一试管，加无水硫酸钠约70 mg脱水后，再精密移取有机层2.60 mL至另一试管中，在室温下用空气吹干，加入与药物摩尔比约为1∶2量的GITC乙腈液(称取GITC 2.0 mg，用1.0 mL乙腈溶解，实验中根据需要用乙腈进一步稀释后使用。)，35 ℃恒温反应30 min，吹干后用NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）300　μL溶解后，色谱进样20 μL。
3　色谱条件
　　色谱柱：Shim-pack CLC-ODS(25 cm×4.6 mm, 10 μm)；保护柱：ODS(10 mm×5 mm，10 μm）；检测波长：254 nm；灵敏度：0.005AUFS；流速:0.5 mL.min-1；流动相：NaH2PO4缓冲液-CH3OH-CH3CN(50∶20∶30)。
　　此条件下阿替洛尔的微粒体孵育液经手性衍生化后的典型色谱图见图2。

图2　阿替洛尔的微粒体孵育液经手性衍生化后的典型色谱图
A.空白鼠肝微粒体孵育液　B.加样鼠肝微粒体孵育液
1.S(-)-阿替洛尔(13.64 min)
2.R(+)-阿替洛尔(16.35 min)

4　鼠肝微粒体的制备
　　大鼠（Sprague-Dawley雄性大鼠，体重160～230 g，浙江医科大学实验动物中心提供）用地塞米松磷酸钠(Dex)诱导处理（Dex溶于生理盐水，po 100 mg.kg-1，3 d；末次给药后，于处死前16 h断食，仅给水），然后断头处死，按文献方法［14］制备大鼠肝微粒体备用，置-20　℃冰冻保存。按Lowry［15］法测定所制得的鼠肝微粒体中的蛋白质浓度。
5　色谱条件的选择
5.1　检测波长的选择　阿替洛尔衍生物峰在228 nm、254 nm吸收值接近，而在280 nm时吸收值很小。在228 nm时有溶剂峰的干扰，而波长增加则杂质吸收减少，基线易走平。故选择波长为254 nm。
5.2　流动相的选择　用甲醇、乙腈、水、2%冰醋酸与NaH2PO4缓冲液(10 mmol.L-1，pH 4.64)分别组成流动相进行试验，结果表明，用水和2%冰醋酸与甲醇配制流动相，分离度较好但峰形较差；流动相改用NaH2PO4缓冲液可改善峰形。在缓冲液中加甲醇作流动相时峰形较好，但一降解产物峰与R(+)-阿替洛尔峰重叠，加乙腈时该降解产物峰与R(+)-阿替洛尔峰已分开但对映体间分离度较差。根据以上结果我们采用混合溶剂（NaH2PO4缓冲液-CH3OH-CH3CN(50∶20∶30）作为流动相（图3），得到较好的分离度（R=1.56）和峰形。

图3　阿替洛尔色谱图
1.　S(-)-阿替洛尔　2. R(+)-阿替洛尔
3. 降解产物

6　提取条件试验
6.1　碱化试剂的选择　阿替洛尔为弱碱性药物，应在碱性条件下提取。分别用浓氨水和氢氧化钠溶液作碱化试剂对水溶液中的阿替洛尔进行提取，比较阿替洛尔的色谱峰面积，以用浓氨水作碱化试剂较好。另外，浓氨水具有挥发性，吹干时易挥去，而氢氧化钠溶液无挥发性，易在有机相吹干时析出白色固体，故以浓氨水作为碱化试剂为佳。
6.2　提取操作试验　提取溶剂的选择应考虑蛋白质沉淀和衍生化反应。文献［8］采用在1　mL血浆中加200　μL氯化钠饱和液沉淀蛋白质，并用乙酸乙酯3 mL作为提取溶剂。在试验中，我们首先改用固体氯化钠0.2 g，比用氯化钠饱和液200 μL有利于水相与有机相分层，且利于将水相饱和后使药物进入有机层中，这从衍生物的色谱峰面积比较得到证明。由于在阿替洛尔与GITC的反应中，水分和醇的存在都不利于衍生物的生成和稳定。采用乙酸乙酯提取，带入的水分较少。同时，将分出的有机层用无水硫酸钠脱水处理，有利于有机层的挥干和阿替洛尔的衍生化反应。
7　衍生化反应条件的选择
7.1　衍生化反应温度和时间的选择　在阿替洛尔消旋体的衍生化反应中，反应温度升高和反应时间延长均有利于衍生化反应，使衍生化产物增加。为有利于反应温度的控制，选择35 ℃烘箱中进行。通过不同反应时间的比较，可知，在30 min以后随着时间的延长，阿替洛尔衍生物峰面积未见增加，故选定反应时间为30 min。
7.2　衍生化试剂的用量　按“7.1”项操作，在35 ℃反应30 min，试验阿替洛尔消旋体与GITC间以不同的比例反应。由实验结果可知，随着衍生化试剂量的增加有利于衍生化反应，但当GITC量过多时未见更好。确定阿替洛尔与GITC反应的摩尔比以1∶2为佳。
7.3　衍生化反应溶剂的选择　按“7.1”项操作，取阿替洛尔消旋体乙腈液(0.22 mg.L-1)10　μL，经提取、吹干后，分别用甲醇或乙腈300 μL溶解后加GITC乙腈液30 μL进行衍生化反应，吹干，再溶于流动相300 μL中。色谱结果表明，在以甲醇作为反应溶剂时几乎无衍生化反应，说明甲醇的存在不利于衍生化反应；用乙腈作反应溶剂则衍生化反应较佳。故衍生化反应可在提取液吹干后，残渣直接与GITC乙腈液反应。
7.4　衍生化产物溶解溶剂的选择　按“7.1”项操作，取阿替洛尔消旋体乙腈液(0.22 mg.L-1)10 μL，经衍生化反应并吹干后，将衍生化产物分别溶于300 μL 乙腈、甲醇、流动相及 NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）中。色谱结果表明，用甲醇溶解的峰面积最小，表明甲醇对衍生化产物的溶解度小，且放置一段时间后在衍生化物R（+）峰旁产生一降解产物峰，说明衍生化产物在甲醇中不稳定；用流动相和 NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）溶解的峰面积则相近，但流动相中含有甲醇，放置一段时间后有明显的降解产物峰（图2）。而用NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）则无此情况，且放置一段时间衍生化产物较稳定，故选用 NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）作为溶解溶剂。
　　据上述试验结果，确定衍生化反应条件为：提取液吹干，残渣加GITC乙腈液(阿替洛尔消旋体与GITC的摩尔比为1∶2)在35 ℃下反应30 min，反应产物用 NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）溶解作为HPLC进样液。
8　方法效能指标的测定
8.1　线性范围　按“2”项操作，分别加阿替洛尔消旋体水溶液(0.1 mg.mL-1)至微粒体溶液中使浓度分别为2，4，8，20，40 μg.mL-1（对映体浓度1～20 μg.mL-1），经提取、吹干、衍生化反应后将衍生化产物溶于NaH2PO4缓冲液-CH3CN混合液（50∶30）300 μL中，进样20 μL进行HPLC分析，测定结果以峰面积为纵坐标对浓度(μg.mL-1)进行线性回归，求得S（-）-阿替洛尔及R(+)-阿替洛尔回归方程分别为：

Y=840 076.5X+141 742.8 　r=0.999 8
Y=873 157.2X+192 187.5　r=0.999 8

8.2　检测限与定量限　按“2”项操作，根据色谱图中的噪音值，按S/N≥3和S/N≥10估计最低检测限（LOD）和最低定量限（LOQ），并配制相应浓度的阿替洛尔进行试验，得阿替洛尔对映体的LOD为55　ng.mL-1，LOQ为145 ng.mL-1 (RSD<7%)。
8.3　日间精密度和准确度　按“2”项操作，在对映体浓度1～20 μg.mL-1范围内以高、中、低3个浓度进行试验，并重复试验4～5 d，测得峰面积，并代入相应的工作曲线求得浓度，计算日间精密度和相对回收率，结果见表1。结果表明，低浓度时日间精密度(RSD)较差，中浓度和高浓度日间精密度(RSD)在10%以内。

8.4　日内精密度和准确度　按“2”项操作，在对映体浓度1～20 μg.mL-1范围内于2，10 μg.mL-1的浓度水平分别平行做4管，测得峰面积值，并代入相应的工作曲线求得浓度值(μg.mL-1)，计算日内精密度和相对回收率，结果见表2。表明日内精密度RSD＜4%。

9　阿替洛尔在鼠肝微粒体中的代谢测定
　　取鼠肝微粒体，用Tris-缓冲液(pH=7.4)和有关试剂稀释制得蛋白质浓度为2.0 mg.mL-1的微粒体液（内含G-6-P 6.08　mg.mL-1、G-6-PDH 1.5 u.mL-1、MgCl2 3 μmol.L-1)，通O2 3 min后，加阿替洛尔消旋体水溶液(0.22 mg.mL-1)使成4 μg.mL-1孵育液，37 ℃预孵育5　min，再按每1　mL孵育液中加NADPH溶液(20 mg.mL-1, 以1%NaHCO3溶液溶解)10 μL启动反应，37 ℃孵育，并分别在0，40，80，160，320 min定时取样，然后按“2”项操作。绘制阿替洛尔的浓度经时曲线，结果见图4。

图4　阿替洛尔在Dex诱导的鼠肝微粒体中的浓度经时变化

　　结果表明，阿替洛尔在经地塞米松磷酸钠诱导的鼠肝微粒体中，代谢经320 min底物浓度下降约15%，但在对映体代谢立体选择性上，阿替洛尔并不很明显，有待于进一步的实验研究

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yangzq4

第1楼2011/04/16

可不可以把图给出，没有图

0

yuduoling

第2楼2011/04/17

资料不错。多谢分享了

0

sjzhang156

第3楼2011/10/03

学习了，不错

0

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