【原创】迪马科技AAA柱子 使用经验（一）

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建立一种快速，高效，节省测定氨基酸的反相高效液相色谱柱前衍生方法。用C18氨基酸专用柱，苯异硫氰酸（PITC）作为柱前衍生的衍生试剂。梯度洗脱程序，流速1.0ml/min,柱温40℃，波长254nm为条件。40分钟内准确完成对18种氨基酸的测定。

衍生方法

1分别取 液1.2ml和 液13.9ml用乙腈定容到100ml

2 取200µL的标样或样品于离心管中分别加入2.2.1配置好的衍生试剂，各100µL，室温静置放置1小时。

3 在衍生好的样品中加入试剂正已烷400µL，震荡后静置10min取下层清液10µL注入色谱仪。

色谱条件

色谱柱：氨基酸分析专用ODS柱；柱温：40℃；流速：1mL/min；波长：254nm。

氨基酸与衍生物在ODS 固定相上的保留强弱与分离效率不仅与ODS 固定相表面C₁₈官能团的键合量、键合所用单体的性质、键合反应催化剂、溶剂等条件有关，同时与固定相所用硅胶微球的宏观和微观性质如粒度分布、平均孔径及孔径分布、孔容、比表面积、金属杂质含量等因素有关。

由于流动相为含盐溶液的有机溶剂，溶剂长期存留在色谱柱中会导致固定相的破坏，建议用户在当天分析工作结束之后用5％的乙腈水溶液洗色谱柱20~30min；然后再用纯乙腈洗色谱柱20~30min才能关机，最终纯乙腈溶剂冲洗色谱柱后储存。建议冲洗色谱柱的每一种流动相体积不小于20mL。

样品成分如果太复杂的话最好 经过一些处理

侧氨基酸的处理程序，我不清楚

但是测有机酸的处理程序如下：

样品预处理
（1）取1ml发酵液10,000r/min离心5min；
（2）取上清0.5ml,加入0.3gNaCL, 0.10ml 2.3mol/L H2SO4, 2.50ml乙醚，在振荡器上混合1min，5,000r/min 离心3min；
（3）取乙醚相1.00ml,加0.20ml0.1mol/LNaOH混合1min，5,000r/min离心3min,吸去上层乙醚，用试纸测试pH>9（在酸性条件下，用乙醚萃取，将有机酸以分子形式萃取到乙醚相中，再在pH>9的条件下反萃取到水相中，可大大去除其他物质的干扰），开盖挥发乙醚相后，置干燥器内干燥；
（4）加入2.5ml 0.02mol/LKH2PO4 （pH2.2）溶解，10,000r/min离心10min；
（5）取1.5ml0.45µm膜过滤注入样品瓶，取10μl进样分析。

如果 样品没有前处理的话

最好在色谱柱之前加上 保护住

保护柱的作用，大家应该都知道了

好处： 分离效果不好的话，不用更换AA色谱柱 直接花300左右 换掉一根保护柱芯就OK~\(≧▽≦)/~啦啦啦

衍生化反应的时间问题

最好还是根据色谱柱的说明书上，反应（1h）

虽然有的文献上，会说衍生化 20分钟 40分钟

最好还是按照氨基酸分析柱说明上 说得来吧

印象中40分钟还可以