去年冬天
第1楼2011/06/05
供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH 值在6.0~8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品,需调节被测溶液(或其稀释液)的pH 值,可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值(L)一般按以下公式确定:
L=K / M
式中 L 为供试品的细菌内毒素限值,一般以EU /ml、EU / mg 或EU / U (活性单位)表示;
K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU / ( kg · h )表示,注射剂K = 5EU/(kg•h ) ,放射性药品注射剂K=2.5EU / (kg· h ) ,鞘内用注射剂K = 0.2EU / (kg· h ) ;
M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量,以ml / ( kg · h )、mg / ( kg · h )或U / ( kg · h )表示,人均体重按60kg 计算,人体表面积按1.62m2 计算。注射时间若不足1 小时,按1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027 即可转换为每千克体重剂量(M)。
按人用剂量计算限值时,如遇特殊情况,可根据生产和临床用药实际情况做必要调整,但需说明理由。
确定最大有效稀释倍数(MVD ) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD ),在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD :
MVD=cL / λ
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第2楼2011/06/05
方法1 凝胶法
λc=antilg (∑X / 4 )
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第3楼2011/06/05
表l 凝胶法干扰试验溶液的制备
编号 | 内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 | 稀释用液 | 稀释倍数 | 所含内毒素的浓度 | 平行管数 |
A | 无/供试品溶液 | —— | —— | —— | 2 |
B | 2λ/供试品溶液 | 供试品溶液 | 1 | 2λ | 4 |
2 | 1λ | 4 | |||
4 | 0.5λ | 4 | |||
8 | 0.25λ | 4 | |||
C | 2λ/检查用水 | 检查用水 | 1 | 2λ | 4 |
2 | 1λ | 4 | |||
4 | 0.5λ | 4 | |||
8 | 0.25λ | 4 | |||
D | 无/检查用水 | —— | —— | —— | 2 |
Es= antilg (∑Xs / 4 )
Et=antilg (∑Xt : / 4 )
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第4楼2011/06/05
检查法
( l )凝胶限度试验 按表2 制备溶液A 、B 、C 和D 。使用稀释倍数为MVD 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A 和B 。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
表2 凝胶限度试验溶液的制备
编号 | 内毒素浓度/被加入内毒家的溶液 | 平行管数 |
A | 无/供试品溶液 | 2 |
B | 2λ/供试品溶液 | 2 |
C | 2λ/检查用水 | 2 |
D | 无/检查用水 | 2 |
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第5楼2011/06/05
(2)凝胶半定量试验 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3 制备溶液A 、B 、C 和D 。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
结果判断 若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性,供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性,系列溶液C 的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ~2λ之间,试验有效。
系列溶液A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ,为每个系列的反应终点浓度,所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式cE=antilg(∑X / 2 )] 。如果检验时采用的是供试品的稀释液,则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性,应记为内毒素浓度小于λ(如果检验的是稀释过的供试品,则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数)。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性,应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值,判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值,判定供试品不符合规定。
表3 凝胶半定量试验溶液的制备
编号 | 内毒素浓度/被加入内毒素的溶液 | 稀释用液 | 稀释倍数 | 所含内毒素的浓度 | 平行管数 |
A | 无/供试品溶液 | 检查用水 | 1 | —— | 2 |
2 | —— | 2 | |||
4 | —— | 2 | |||
8 | —— | 2 | |||
B | 2λ/供试品溶液 | 1 | 2λ | 2 | |
C | 2λ/检查用水 | 检查用水 | 1 | 2λ | 2 |
2 | 1λ | 2 | |||
4 | 0.5λ | 2 | |||
8 | 0.25λ | 2 | |||
D | 无/检查用水 | —— | —— | —— | 2 |
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第6楼2011/06/05
方法2 光度测定法
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第7楼2011/06/05
干扰试验 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度(设为λm),作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4 制备溶液A 、B 、C 和D 。
表4 光度测定法干扰试验溶液的制备
编号 | 内毒素浓度 | 被加入内毒素的溶液 | 平行管数 |
A | 无 | 供试品溶液 | 至少2 |
B | 标准曲线的中点(或附近点)的浓度(设为λm) | 供试品溶液 | 至少2 |
C | 至少3 个浓度(最低一点设定为λ) | 检查用水 | 每一浓度至少2 |
D | 无 | 检查用水 | 至少2 |
R = (cs-ct ) ×100 %
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第8楼2011/06/05
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
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第9楼2011/06/05
供试液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃ 。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时。
除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品
取供试品10ml ,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ,混匀,作为l:10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品
取供试品10g ,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml ,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1:10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80 ,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。
3.需用特殊方法制备供试液的供试品
(1)非水溶性供试品
方法1 取供试品5g(或5ml ) ,加至含溶化的(温度不超过45℃ )5g司盘80 、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加人45 ℃ 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1 : 20 的供试液。
方法2 取供试品10g ,加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录XII A 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中.必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45 ℃ 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10Oml ,振摇5~10 分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为l : 10 的供试液。
(2)膜剂供试品
取供试品100cm2,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml (必要时可增加稀释液),浸泡,振摇,作为1:10 的供试液。
(3)肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g ,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml ,置45 ℃ 水浴中,振摇,使溶解,作为1 :10 的供试液。
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第10楼2011/06/05
(4)气雾剂、喷雾剂供试品
取规定量供试品,置冰冻室冷冻约1 小时,取出,迅速消毒供试品开启部位,用无菌钢锥在该部位钻一小孔,放至室温,并轻轻转动容器,使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液,加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(若含非水溶性成分,加适觉的无菌聚山梨酯80 )中,混匀,取相当于10g或10ml 的供试品,再稀释成1:10 的供试液。
(5)贴剂供试品
取规定量供试品,去掉贴剂的保护层,放置在无菌玻璃或塑料片上,粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料(如无菌纱布)覆盖贴剂的粘贴面,以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂(如聚山梨酯80 或卵磷脂)的稀释剂中,用力振荡至少30 分钟,制成供试液。贴剂也可采用其他适宜的方法制备成供试液。
(6)具抑菌活性的供试品
当供试品有抑菌活性时,采用下列方法进行处理,以消除供试液的抑菌活性,再依法检查。常用的方法如下。
① 培养基稀释法 取规定量的供试液,至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少,至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时,取同稀释级的供试液2ml ,每1ml供试液可等量分注多个平皿,倾注琼脂培养基,混匀,凝固,培养,计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数,计算每1ml供试液的平均菌落数,按平皿法计数规则报告菌数;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。
② 离心沉淀法 取一定量的供试液,500 转/分钟离心3 分钟,取全部上清液混合。用于细菌检查。
③ 薄膜过滤法 见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。
④ 中和法 凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品,可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。