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【资料】纠正误区:反相液相色谱柱不是LC-MS/MS分析的主流

液质联用(LCMS)

  • 对于LC-MS/MS色谱柱人们的惯性思维通常是由反相液相色谱柱开始研发, 产生这种惯性思维是因为常规高效液相色谱分析中C18等反相高效液相色谱柱占有统治地位,另一方面是色谱公司不懂LC-MS/MS分析误导用户的结果。这惯性思维是不正确的!
    LC-MS/MS分析的实用战略和HPLC有很大不同! LC-MS/MS分析的方法的选择性最重要!
    色谱公司不能简单地将现成的反相液相色谱填料装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用, 但事实上几乎所有色谱公司都是这样做的。这样的反相液相色谱LC-MS/MS柱有三个明显的弱点:
    (1) 许多极性化合物难以保留,质谱灵敏度差。
    许多重要的物质,如抗癌药物DTIC, 抗痛药物河豚毒素,污染物质三聚氰胺, 中草药中糖肽等非常极性, 在反相液相色谱柱上没有保留。还有许多的化合物比较极性, 使用少量的甲醇或乙腈就从反相液相色谱柱上洗脱。在药物代谢研究中, 观察到许多化合物自己疏水, 但代谢产物亲水的情况。甲醇或乙腈含量低, 离子化程度低, 质谱灵敏度差。所谓水相C18柱在LC-MS/MS分析中没有价值。
    (2) 用常规反相色谱填料装成2.1mm内径的色谱柱在LC-MS/MS和LC/MS应用中常陷入记忆效应(Carryover Effect)的“陷阱”
    LC-MS/MS和LC/MS应用中另一个重大问题是记忆效应(Carryover Effect)。记忆效应是指在进样后, 再进一针空白在同样的保留时间仍然观察到化合物峰。记忆效应的副作用是明显的: 它可能人为地增加下一样本的MRM信号, 影响定量分析的精密度和准确度。US FDA Bioanalytical Regulatory Guidances限制最高校准标准(highest calibration standard) 的记忆效应不能超过20 %最低校准标准(lowest calibration standard)MRM信号的20%。
    由于大部分色谱公司都使用现成的反相液相色谱填料简单地装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱, 在许多情况下,使记忆效应强, 校准标准曲线范围必须人为缩短, 或不得已在进样后, 再进一针甚至两针空白最小化记忆效应, 然后进下一个样品。所有这些严重地降低了生产效率。
    (3) 峰形拖尾或扭曲
    因为活性硅醇基无法完全封闭, 许多碱性化合物在几乎所有色谱公司的反相液相色谱柱上面有明显的峰形拖尾。这种峰形拖尾是记忆效应的一个重要的根源。
    另一方面,使用不正确方法过分封闭致使一些酸性和两性化合物分离效果不佳, 特别是出现峰失真和分裂现象。
    专家认为LC-MS/MS色谱柱和色谱方法的第一选择是亲水色谱(HILIC或Cogent Diamond Hydride)! 亲水色谱使用乙腈作为弱溶剂和水为强溶剂, 彻底解决质谱灵敏度差, 记忆效应等问题。疏水化合物首先流出, 然后是亲水化合物。不仅彻底解决极性化合物难以保留的问题, 而且同时分析了疏水化合物, 也提高了疏水化合物质谱灵敏度。峰形拖尾问题也获得彻底解决。此外,乙腈提取液不需要蒸发和重新溶解,从而节省了大量的时间。另一方面, 反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法仍然重要, 不仅是一些重要的中性化合物如抗癌药物紫杉醇, 抗免疫器官植入药物FK 506和雷帕霉素(rapamycin), 降脂药等必须使用反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法, 还因为大多数客户习惯于反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法。即使这样反相液相色谱填料也必须通过处理才能装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用。
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  • netsking

    第1楼2011/06/16

    请问HILIC柱是什么才开始有的? 反相柱在LCMSMS的发展中所起的作用就不说了.

    对于LCMSMS柱子, 应该是什么柱都可以, 只是不同的柱子需要自己研究方法.另一个原因用流动相必须能使分析物以离子形式存在. 所以, 以此为出发点, 对于用什么相柱就是不是那么重要了.

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  • dahua1981

    第2楼2011/06/16

    应助达人

    反相柱是主流吧

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  • kylabs

    第3楼2011/06/17

    反相现在用的肯定是最多的。但是极性的确实反相LCMS很难解决问题。

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  • 第4楼2011/06/17

    太有失偏颇了吧。。
    反相虽然不是万能的,但是它的地位短期内正相还是无法动摇的吧

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  • johne0212

    第5楼2011/06/17

    极其不同意记忆效应是由于色谱柱引起的。

    自动进样器的Carryover才是主要的原因,至于由于记忆效应引起的标准曲线范围缩小,这样的话也值得怀疑。

    标准曲线线性范围的缩小,主要是由于MS的灵敏度有关系的,质谱的灵敏度和标准曲线的线性范围是两个矛盾的东西,你要追求灵敏度可能就要牺牲线性范围,我这里有个实例。
    现在这边有人用API作硝基呋喃,以前在API4000上做AMOZ的线性范围从0到80ppb,可是现在换到API5500,线性范围只有在0到40ppb,为什么呢不用说也明白。
    但是,同意用HILIC或者正相色谱柱作为以后再质谱上发展的趋势,因为再用HILIC或者正相柱的时候离子源的雾化效果会比反相的更好,提高灵敏度。

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  • 蓝精灵

    第6楼2011/06/18

    很好的讨论话题啊!Carry over与化合物类型和柱填料类型有关,HILIC柱子没用过,但近两年经常听说

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