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显微摄影技术二

zhbvssong

2011/09/01

生物显微镜

第二章进行显微摄影
一．显微摄影的基础知识
1．显微摄影装置的放大倍率
照片的放大倍率，决定于照相目镜的型号和显微摄影装置的投影长度。如前所述，目前光学显微镜的光路系统是万能无限远光学校正系统，与以前的有限远光学校正系统有了很大的改进。所以两种系统的照片放大倍率计算方法不同。
(1) 有限远光学校正系统：　照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率（没有中间附件时）或照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率X中间附件系数（连接有中间附件时）。
(2) 万能无限远光学校正系统：　照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率（中间附件不影响放大倍率）。
(3) 大版照相：照片总放大倍率=物镜放大倍率X照相目镜放大倍率X 3。
照片的总放大倍率是指底片上图象的放大倍率，而不是指底片冲洗到相纸后的放大倍率。
2．物镜与目镜的不同组合，得到的分辨率不同
即使照片的总放大倍率相同，它的分辨率是根据物镜、目镜的不同组合而不同的。在显微摄影时应尽量使用低倍照相目镜与高倍物镜组合，这样能改进底片平面象的分辨率。
3．标本画面的构图
显微摄影时，视场中的标本往往不适合摄影构图，克服这个问题的办法是转动照相机，以使标本成比例得适合构图的要求。但这时要进行操作显微镜来适合摄影构图就更困难了。一般人们乐用的方法是转动载物台，将标本调到画幅理想的构图中。
二．显微摄影技术
1．工作前的准备
(1) 光路系统的清洁　　显微摄影必须保证光路系统的清洁，任何光学部件有了污垢及灰尘，均会影响照片的质量。物镜、目镜及聚光镜等部件，如污垢长期得不到清理，还会引起霉菌的生长，致使不能应用。各部件在擦拭时，只能清理表面，而不应任意拆卸。
(2) 光轴中心的调整　　显微摄影时光轴中心的调整是绝对不可忽视的，否则拍出的图象，各部分的感光不匀。关于调整的方法前已述及，这里不予重复。
(3) 其它准备工作　　检查镜体与照相系统的安装是否正确；根据被检物体的情况选用何种感光片；如为半自动和全自动照相系统，需调节好相应的按钮。拍摄前需用观察目镜观察，先调好两眼的瞳距，使两个视场的象合而为一，再调节好两眼的屈光度以适应观察者的视力。
2．视场光阑与孔径光阑的应用
视场光阑的作用前已述及，在观察时根据物镜的倍率不同视场光阑开大或缩小而给予相应的光束面积，以达到镜检的优良效果。在显微摄影时它起着增加和减弱影象反差的作用。当视场光阑开大到一定程度时，照射到被摄物体上的光，即会产生反射与不规则的散射，造成影象反差的损失；当视场光阑收缩到取景框边缘的外方时，图象的反差就得到改善；视场光阑过度的收缩接近取景框，则图象的四角部分将被切去。因此，在显微摄影时，视场光阑的应用是重要的一个因素，应开启到比取景框稍大的位置。
3．人眼屈光度的校正
镜检时，每人眼睛的屈光度不尽都一致，总是存在着一定的差别。当甲看清视场中的图象后，乙来观察时就不一定清晰，这是由于两人眼睛的屈光度有所不同而造成的，这一差别很易解决，只要调节一下微调焦旋钮就很容易使图象清晰。但是在显微摄影时，用这种方法是不能解决的，因为上述是通过改变工作距离的长短来补偿两人的屈光度；而显微摄影则必须使物镜处于它本身的工作距离处，使成象清晰地落在感光片的平面处，才能使感光片得到清晰的图象。往往有这样的经验，在视场中观察到的图象很满意，可拍摄出来的底片则模糊不清，就是这个原因。
显微摄影的调焦方法，必须利用取景侧目镜（聚焦望远镜）或取景目镜，首先进行屈光度的校正，即旋转取景侧目镜或取景目镜上的圆环，使取景框中的双十字线达到最清晰的程度，这时再进行调焦使图象清晰，便可进行曝光。但应指出，应用同一只眼睛调节，不然两眼之间也会存在屈光度的差异。在调节双十字线时，应尽快予以调整，否则长时间的调整，人眼将产生适应性，则不易调得准确，如遇此情况，可远眺前方稍待一段时间后再进行调节。
在使用4X以下物镜时，由于焦深较长，只用取景目镜还会发生调焦的误差，这时可利用“聚焦放大镜”来克服误差。其方法是将聚焦放大镜放在取景侧目镜或取景目镜上，拧紧固定螺钉，再旋转该镜筒上的圆环，看清双十字线后物象是否同时清晰，如不清晰，再进行调节。在使用10X和20X物镜时，当双十字线与图象同时清晰后，用眼环视一下，看双十字线与图象是否有移动现象，如果图象不移动，则说明焦点已对准；如有移动，需用微调重新调节。
4．曝光的补偿
拍摄显微照片时，根据被摄物体组织结构所占帧幅面积的百分比需要调节曝光补偿。在明场情况下，如果组织结构的各部分在帧幅内均匀分布，这样不论是平均测光还是点测光，都不需要曝光补偿；若被摄物体所占的面积小或分散，则需要进行曝光补偿，加长一些曝光时间，否则被摄物体的曝光不够。反之，在暗场情况下，物象是明亮的，在曝光的补偿上就需要减少一些曝光时间。
5．感光片倒易率失效的补偿
感光片感光乳剂的曝光，有着一定的规律—倒易律，即曝光是以投射到感光片表面上光的亮度而决定得。根据这一规律，总曝光量为光的强度乘以时间的积。在日常的照相中，如果光圈f/8时，则曝光时间为1/125s（秒）；若将光圈缩小一档，即缩小为5/11，则曝光时间相应地增加一档，即为1/60 s，这样两者的总曝光量是相同的，当显影后，底片上的密度也是相同的。但当曝光时间超过一定范围后，则这一规律就不起作用，导致曝光不适和引起颜色还原的不良现象，这种现象称为“倒易律失效”（reciprocity failure）。
在显微摄影中，不能通过聚光镜的孔径光阑的大小来补偿曝光时间，否则会影响物镜的成象质量，只有在倒易律的范围内适当延长或缩短曝光时间，才能获得适当曝光的底片及密度水平。在全自动显微摄影装置的控制器上，装有倒易律失效旋钮，可根据不同感光片所指出的倒易律失效系数来设置，这样在曝光时，就能自动进行补偿，而获得合适的曝光效果，在彩色显微摄影中，对于这一规律的应用尤为重要。
三．彩色显微摄影
1. 彩色感光片
目前市场有许多各种不同类型的彩色片，选择合适的型号才能获得理想的显微摄影效果。
（1）彩色感光片的分类
根据用途的不同，可分为彩色负片、彩色反转片与彩色正片。彩色负片是经冲洗后，形成三原色的补色，经彩色相纸印放后，成为原色的图片；彩色反转片经冲洗后，直接形成三原色，成为和物体颜色相同的透明正片；彩色正片不能直接用于拍摄，只能供给彩色负片翻印成彩色透明正片。
根据拍照时所应用的光源不同，彩色负片与彩色反转片还分为日光型、灯光型以及混合型。彩色正片只是灯光型。
日光型彩色片在拍照时，要求光源的色温在5500°K左右；灯光型则要求色温在3400°K左右；至于混合型彩色片，对色温的要求约在4000°K左右。
（2）选用彩色片的要求：
a) 要求感光片有高解像力，因为显微照片需要显示标本的微细结构
b) 要求对组织中的同一种颜色能显示标本颜色间深浅的微细差别
c) 要求在背景不变的情况下，能真实地显示标本的原来颜色
鉴于以上要求，适合摄影用的彩色片必须具备下面条件：
a) 微粒
b) 颜色反差好
c) 颜色还原好
由于大部分显微摄影是投射光的明场照明，因而选用感光度ISO/ASA50到100之间的彩色片，就能保证得到比较满意的质量。
当拍摄暗场（相衬、偏振光、荧光）时曝光时间要增加。在多数情况下，选用高感光度ISO/ASA的感光片，因为需要感光度速度快。虽然影象颗粒大一些，也不会有很大的影响。
2. 滤色镜在彩色摄影中的应用
显微彩色摄影常用的滤色镜有以下几种
(1) 色温转换滤色镜：用于将显微镜照明光源的色温转换成底片所要求的标准。根据底片的不同要选用相应的滤色镜。
(2) 彩色补偿滤色镜（CC，Color Compensation）：当拍摄的彩色照片的背景不是白色而有颜色时，可参考下表选用补偿滤色镜
校正照片所偏的颜色需要加用的彩色补偿滤色镜
Red 红青 CCC
Green 绿品红 CCM
Blue 蓝黄 CCY
Cyan 青红 CCR
magenta 品红绿 CCG
Yellow 黄蓝 CCB
四．黑白显微摄影
1．黑白感光片
由于显微摄影所需要的拍摄条件与一般摄影不同，因而要根据摄影条件来选择感光片。例如，生物学的标本需要反差强、颗粒细的感光片，以得到清晰度高的摄影效果，这类感光片在市场上是能买到的，如Kodak Panatomic X 、 Agfapan 25、Ilford Pan F 和Fuji Neopan F。
黑白感光片的型号很多，要使拍摄出来的照片质量优良，必须选用合适的感光片。下表供使用中参考。
标本组织的条件选用的感光片 ISO/ASA 备注。
普通病理学标本染色的部分，需要得到正常反差习惯，或者是高反差的效果 Koadk Panatomic-XIlford Pan FAgfapan 25Fuji Neopan F 32502532 按标本的颜色选用不同反差效果的滤色镜。
病理学标本组织片染色的部分以及其它部分，需要得到低反差，要求标本外形的清晰度比其内部结构的层次更重要 Kodak Techical Pan 2415Agfaortho 25Fuji Minicopy HR-11 641002532 这类感光片反差很高，而感光宽容度很窄。除非事先试拍，找出最佳曝光时间以后，再将曝光调节钮放在±1/3档上，这样才能得到既不曝光过度，也不曝光不足的正常底片。
暗背景的标本组织，需要长时间的曝光，才能得到正常底片的密度 Kodak Tri-X PanAgfapan 400Ilford HP 5Ilford XP 1Fuji Neopan 400 40040040050-1600400 用这一类感光片，曝光时间缩短，但底片影象的颗粒就变粗了。
2．滤色镜在黑白摄影中的应用
黑白感光片没有对色温的要求，一般不需要色温平衡滤色镜和补偿滤色镜。应用最多的为反差滤色镜。
反差滤色镜用来控制黑白摄影的反差。常用的是绿色滤色镜，但要得到最有效果的滤色镜，还要根据标本的特点来选择。可增强标本颜色的滤色镜请参考下表：
标本的颜色　　滤色镜的颜色
红色　　　　/　黄色绿色
黄色　　　　/　橙色蓝色
蓝色　　　　/　橙色
如果要减弱标本的反差，请用与标本颜色相同的滤色镜。例如，蓝色标本组织就用蓝色滤色镜，这可以使蓝色的标本组织反差降低。其它色依此类推。
四． OLYMPUS 显微镜光学系统简介
OLYMPUS 显微镜光学系统的设计有三种光学系统。
1 长筒光学系统（LB）：OLYMPUS CH2、BH2显微镜是此种光路设计。
2 万能无限远校正光学系统（UIS）：应用在OLYMPUS 最新型显微镜如BX IX CX 等。UIS是目前最先进的光路设计，它分体现了无限远校正方式的优越性。光线通过物镜后成为平行光束通过镜筒，并在结象透镜处折射或完成无相差的中间象。物镜与观察筒内结象透镜之间可添加光学附件，而不影响总放大倍数。另外UIS 光学系统不需要安装附加校正透镜，在一切OLYMPUS BX系统构成中都能得到最佳的显微图象。

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dahua1981

第1楼2011/09/02

应助达人

好好学习一下

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