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用分光光度计发测样品中葡萄糖的含量

fly604

2006/02/28

其他仪器综合讨论

食物中葡萄糖的测定
葡萄糖氧化酶法
1.原理
葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下产生葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下使邻联甲苯胺生成蓝色物质，此有色物质在625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。通过测定蓝色物质的吸光度可计算样品中葡萄糖的含量。
2.适用范围
适用于谷类、乳类、饮料、酒类等食物样品和血液样品。检出量为0.02 mg。
3.仪器
722分光光度计。
4.试剂：
除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1）乙醇。
（2） 40% 三氯乙酸：称取40g 三氯乙酸，用水溶解并稀释至100ml。
（3） 2 mol/L NaOH 溶液：称取8g NaOH，用水溶解并稀释至100ml。
（4） 1 % 邻联甲苯胺溶液：称取0.1 g 邻联甲苯胺溶解于10 ml无水乙醇中，倒入棕色瓶中，4 ℃ 冰箱保存。
（5）乙酸缓冲液（pH 5.0）：称取14.28 g 乙酸钠（CH3COONa•3H2O）溶于水中，加入2.7 ml 冰乙酸，并调节pH 5.0，用水定容至1 L。
（6）葡萄糖氧化酶溶液：称取一定量的葡萄糖氧化酶（Sigma 公司）用水溶解，使酶含量为100 U/ml。4 ℃ 冰箱保存一周。
（7）过氧化物酶溶液： 0.010 g 辣根过氧化物酶溶于10 ml 水中，4 ℃ 冰箱保存一周。
（8）酶溶液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、葡萄糖氧化酶溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃ 冰箱可保存七周。
（9）酶空白液：取100 ml 乙酸缓冲液，分别加入邻联甲苯胺溶液、过氧化物酶溶液各1 ml，混匀。4℃ 冰箱保存一周。（注意酶空白液中不含葡萄糖氧化酶）
（10）葡萄糖标准液：将葡萄糖标准品（纯度大于99%）于80 ℃干燥至恒量。精确称取0.050 g，用水移入100 ml 容量瓶中，定容至刻度线。相当于浓度为0.5 mg/ml。
5.操作步骤：
5.1样品处理：
（1）固体样品：称取0.5～5g已粉碎的样品于锥形瓶中，加入50ml水后沸水浴15min。冷却后，转移至100ml容量瓶中并用水定容至刻度。反复摇动混匀样品，过滤，弃初始几滴滤液。收集滤液。如果滤液澄清，可直接或经进一步稀释后用于测定。如果滤液浑浊，吸取20ml滤液转移至另一容量瓶中，加入无水乙醇至刻度。混合后静置至少30min。过滤，滤液用于测定。
（2）液体样品，寡糖、淀粉等碳水化物水解液：吸取2～10ml样品或水解液，加入4倍量乙醇，混和。静置至少30min，过滤后滤液备用。（如果过滤后滤液仍浑浊，或样液体积过少，可3000rpm离心15 min，上清液备用。）
注：样品处理中80% 乙醇的用途是沉淀不溶性多糖和部分蛋白质。
5.2测定：标准管和样品测定管，按下表所列操作（单位：ml）

试剂
标准空白管
葡萄糖标准管
样品空白管
样品测定管

葡萄糖标准液
——
0.1～0.5
——
——

样品提取液
——
——
0.5
0.5

水
0.5
补至0.5
——
——

酶溶液
5
5
——
5

酶空白液
——
——
5
——

上述试剂混合后37℃ 水浴反应 15 min， 625 nm 测定吸光度值。
（注意：葡萄糖与酶溶液的成色反应与反应时间密切相关，如反应时间过长，溶液颜色会由蓝转变成灰色，并慢慢产生沉淀，所以反应时间应严格控制好。）
6.计算
根据吸光度值求出葡萄糖标准曲线的回归方程，采用插入法求出样品测定管中葡萄糖含量，再根据稀释定容体积和称样量，计算出样品中葡萄糖含量。
计算公式：
X= (As-Ab)×V×F×0.1
0.5×m
式中:
X——样品中葡萄糖含量，g/100g;
As—— 由标准回归方程求出的样品测定管中葡萄糖含量，mg；
Ab——由标准回归方程求出的样品空白管中葡萄糖含量，mg；
V——样品定容体积，ml；
F——稀释倍数
0.5——测定时吸取样品提取液的体积，ml；
m——样品质量，g；
0.1——将mg/g转换成g/100g的系数。
7.注意事项
（1）此方法中的酶溶液只能和葡萄糖反应，特异性强，灵敏度高。
（2）如果样品提取液为无色，无需做样品空白。但是有些样品颜色很深，如饮料、菌藻类食物，或样品提取液浑浊，往往干扰测定结果但又难以去除，所以测定这类样品时需做样品空白管以减少干扰。
我想问一下：

---有一个37度水浴加热，到底要几分钟，一开始我加了15分钟，但加完后，上半部分就变灰黄色，但冷却时会重新变回绿色，这有影响吗？
我后来又重配试剂作了一次，但刚把酶溶液加入葡萄糖标准溶液还没加热就变兰色了，后来只要加热几分钟颜色就会变灰黄，这怎么回事？还要加热吗？

暂时就这些，希望大家帮忙，谢谢！！！

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我在故我思

第1楼2006/02/28

我在资料中心上传了一篇关于这个的文章，建议您下载之后看看！

0

fly604

第2楼2006/03/01

抱歉，我没看到啊，而且就算有，我也没下载的资格呢

0

fly604

第3楼2006/03/21

拜托各位专家，帮我分析分析吧

0

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