省部重点实验室
第1楼2011/11/19
3 讨论
Hb A2的检测在血红蛋白病的诊断中具有重要价值[1、2],Hb A2升高是诊断-地贫的指标,较低值的Hb A2则显示为-地贫和缺铁性贫血[11]。对于血红蛋白H病,Hb A2通常表现为减低,其含量通常明显较-地贫携带者低;而血红蛋白E携带者则由于Hb E与Hb A2的等电点相近,在电泳中二者处于同一位置而表现为“Hb A2”明显升高。这与CIEF检测Hb A2所得数据(-地贫携带者[均值±1SD]:3.46%±0.41%,正常成人:4.41%±0.42%,-地贫携带者:7.04%±0.71%,H病患者:1.14%±0.27%,血红蛋白E携带者:29.84%±0.74%)一致。
分析得到的CIEF的实验数据,-地贫携带者Hb A2含量的95%可信区间为2.65%~4.29%,-地贫携带者的含量为5.61%~8.47% ,-地贫携带者与正常参考值有部分交叉(见图3、4),由于正常成人的红细胞指数正常,而地贫携带者则表现出小细胞低色素特征,故结合红细胞指数,CIEF可以很好地将三者区分。血红蛋白E病例为-地贫类型之一,其Hb A2由于难以与Hb E分离,故其特异的高峰可作为诊断依据。为了观察Hb H病患者的Hb A2的CIEF检测情况,我们用CIEF检测了3例经基因分析证实的Hb H标本,结果为0.9%~1.43%,低于-地贫携带者的测定值,且与-地贫携带者的Hb A2值范围(2.65%~4.29%)无交叉,表明该指标可用于诊断Hb H。
我们所得到的正常参考值为:3.59%~5.23%,与常规血红蛋白电泳的正常参考值:2.5%~3.5%相比明显偏高,这与其它研究者所得结果相似[3,11,12]。其原因可能是因为不同的仪器、检测方法和计算方法引起的偏差。
国内常用的 Hb A2定量方法是电泳法和离子交换微柱层析法。电泳法需要首先制备血红蛋白溶液,除去血浆、白细胞和血小板,将其制成一定浓度的血红蛋白溶液,然后进行电泳,电泳后则需要将支持物上的电泳带浸泡出来比色定量或进行扫描定量。步骤多,程序复杂,受干扰因素多,定量受支持物透明程度和浸泡是否彻底以及分光光度计灵敏度和扫描仪精度的影响而无法实现精确定量。离子交换柱层析法是一种比电泳法精确,分辨力高的方法,但由于该方法较烦琐且成本较高而不适合临床常规筛查。
我们的实验结果显示,CIEF分析Hb A2具有以下特点:①高效:检测一个样品只需10分钟即可完成。②自动化程度高:只需将溶血的全血或红细胞液与甲基纤维素工作液混匀后,上样于毛细管电泳仪即可,其余的工作均由毛细管电泳仪自动完成。③特异性好:根据Hb A2的峰面积大小,结合红细胞指数(小细胞低色素)即可区分-地贫,-地贫,Hb E等阳性样品。④稳定性、精确性好:通过对比样品内与样品间的变异系数显示出该方法较好的精确性和重复性。⑤准确率高:用CIEF分析93例异常血红蛋白样品,经基因型分析,全部诊断为地贫携带者(43例-地贫,44例-地贫,3例Hb E),表明该方法具有较高的准确率。诊断结果与临床常规方法之间的符合程度高。
用该方法进行地贫筛查时,需注意以下几方面:①样品不能冻存,只能冷藏(0~4℃),且不能超过一个星期。②上样时,血细胞必须与溶血剂充分混合至完全溶血后方可上样。③所用试剂新鲜配制时必须经0.2m滤膜过滤,以免堵塞毛细管。试剂不宜贮存过久。④两性电解质液必须用前新鲜配制,配好后不宜超过12小时。⑤甲基纤维素工作液必须用前新鲜配制。同时,其如下应用受限因素需加以考虑:①与目前的常规方法一样,由于Hb E与Hb A2等电点非常接近,故不能将二者分开。②该法难以将Hb F与Hb A完全分开,故在某些Hb F增高的地贫突变类型筛查时,有一定缺陷。③需要专门的设备,且设备价格较高。④样品不能长期保存。⑤待测样品较少时,会造成试剂浪费。