利用紫外和荧光光谱扫描技术开发高效液相色谱-荧光检测方法全过程
荧光是光致发光中的一种，荧光过程是物质吸收入射光进入激发态，从激发态回到基态并发出波长更长得光的过程，在此过程中，物质吸收的光为激发光，发出的光为发射光（这个定义并不准确，有兴趣的版友可以参照相关教科书）。荧光检测在高效液相色谱中是比紫外检测更灵敏的检测方法，但是能够发出荧光的物质并不多，如何判断分析物有没有荧光特性并优化荧光检测器参数是荧光检测方法开发过程的重要内容。荧光检测方法优化的最重要两个参数是确定激发波长和发射波长。
二极管阵列检测器（DAD）可以提供分析物在流动相的紫外吸收光谱，基于提取的紫外吸收光谱在日常高效液相色谱分分析中主要有两大作用：1.发现并确定紫外检测器的最佳检测波长；2进行进一步的运算做峰纯度检查，判断有没有共流出物。
在这里通过实例向大家介绍二极管阵列检测器的另一用处：二极管阵列检测器辅助荧光检测器开发分析物的高效液相色谱-荧光检测方法。
1实验设备和基本实验条件：
Waters 2695分离单元
Waters 2996 二极管阵列检测器
Waters 2475 荧光检测器
二极管阵列检测器和荧光检测器串列，荧光检测器在后（检测池耐压较差）二者之间死体积为1ml/min×0.1min。
分析物为两种原料药
色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm
柱温：30℃
流动相：乙腈：醋酸盐缓冲溶液=65:35
2实验A：二极管阵列检测器获取紫外吸收光谱，荧光检测器扫描发射光谱
实验仪器设置 :
2996 3D采集模式，获取210-400nm紫外吸收谱图
2475 3D采集模式，固定激发波长220nm（一般有紫外吸收的物质在210-230nm都有吸收），获取250-650nm发射光谱。
利用二极管阵列检测器来判断化合物的出峰时间，图1是在254nm下提取的分析物1和分析物2的色谱图，信号很弱。依照二极管整列检测器提取的色谱图，根据连接二极管阵列检测器和荧光检测器的管路体积，推算二者之间死时间约为0.1min。在荧光检测器中调出发射波长3D图，在250-650nm每间隔50nm提取一次色谱图（即250nm，300nm，350nm…），根据紫外色谱图的分析物保留时间，确定荧光色谱图中分析物的出峰时间。
图1 二极管阵列检测器色谱图和提取的分析物紫外吸收色谱图
在提取的荧光色谱图中，分析物1有荧光（300nm，图2），而分析物2没有。在荧光检测中，会有很多杂质峰出现（图3，在发射400nm提取的色谱图），而紫外检测器中不一定会发现，利用二极管阵列检测器获得的谱图有利于准确定位分析物在荧光色谱图出现的位置，排除杂质干扰（图3）。
图2 从激发波谱300nm发射光提取的色谱图
图3 从激发波谱400nm发射光提取的色谱图。荧光杂质干扰出现。
荧光现象中有量子的跃迁和能级的变化，这些跃迁遵循跃迁定律，有些跃迁是禁阻的，表现为分析物对特定波长的光有选择的吸收。采用二极管阵列检测器可以确定最大吸收波长，为确定荧光最佳激发波长作为参考。分别提取分析物1和分析物2的紫外吸收谱图（图1），分析物1的最大吸收峰为273.5nm，分析物2的最大吸收峰为237.5nm（与文献中推荐的280nm和239nm基本符合），而分析物1的绝对吸收度很低。
在以210nm激发光获取的发射光谱中，分析物1的最佳发射波长是290nm（图4），分析物2只有背景杂散光，没有荧光（在后续实验中设置发射波长239nm，同样发现分析物2没有荧光）。
图4 分析物1的荧光发射波谱图。
为了避免瑞利散射灯散射光对分析物自发荧光的干扰，要求激发波长和发射波长大于20nm，根据紫外吸收谱图，最佳激发波长为273.5nm，荧光发射光谱最佳发射波长为290nm但是在荧光检测中，为了避免瑞利散射灯散射光对分析物自发荧光的干扰，要求激发波长和发射波长大于20nm，这就非常难选择了，所以下一步优化激发波长和发射波长。
3实验B: 优化激发波长和发射波长
在药典和文献中分析物1的紫外吸收最佳波长是280nm，考虑到二极管阵列检测器和荧光检测器光路不通和扫描带宽的问题，需要在荧光检测器中进一步确认激发波长。固定激发波长310nm，扫描250-290nm的激发光谱，图5的激发谱显示最佳激发波长为278nm。
图5分析物1的荧光激发波谱图。
现在的问题是选择最佳激发波长还是最佳发射波长，二者不可兼得。那用实际实验说话吧。分别验证激发270nm-发射290nm（图6），激发270nm-发射300nm，激发280nm-发射300nm，激发280nm-发射310nm（图7）四种实验条件。在270nm激发条件下，色谱峰高仅为280nm条件下激发三分之一，而在280nm激发条件下，选择310nm作为发射波长信噪比最高。
图6 分析物激发270nm-发射290nm色谱图
图7 分析物激发280nm-发射310nm色谱图
所以确定激发波长280nm，发射波长310nm。
4实验C:优化增益因子PMT
增益因子PMT是调整荧光检测的重要参数。在这里以我们的笔记本音箱举例子，调节音量按钮其实就是调节PMT，实际是调节放大器的放大倍数，当调节到较小的值，听不清楚声音，调节太大，音箱会破音失真。调节荧光检测的PMT的最终指标是最佳信噪比。表1是最终结果。PMT1（图8）的峰高小于PMT10（图9）的峰高，当PMT为40，噪音增加。
表1 PMT增益因子实验结果
| PMT | 1 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| 峰高 | 254387 | 260389 | 264800 | 262705 | 269201 | 294936 |
| 信噪比 | 148 | 150 | 162 | 160 | 159 | 63 |
图8 PMT=1色谱图
图9 PMT=10色谱图
图10 PMT=40色谱图
在设置PMT10,20,30时性噪比变化不大，初步选择为PMT10，考虑误差，有进一步优化的必要。
5结论
以上为结合二极管阵列检测器开发荧光检测高效液相色谱方法的过程。我们可以看到二极管阵列检测器串联荧光检测器在开发方法中有众多优势：
1二极管阵列检测器辅助判断分析物有无荧光特性，确定分析物的保留时间。
2二极管阵列检测器辅助判断分析物最佳激发波长。
3考虑两种检测器光路设计和波谱扫描的差异，方法需要仔细确认。
应助达人
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