[苹果检测话题活动]液相色谱质谱联用法测定苹果中的杀菌剂：乙基二硫代氨基甲酸酯盐类

abcdefghijkl123

2011/12/24

私聊

农残检测

液相色谱质谱联用法测定苹果中的杀菌剂：乙基二硫代氨基甲酸酯盐类

摘要建立了苹果中乙基二硫代氨基甲酸酯盐类残留的液质串联确证快速检测方法。苹果样品中的乙基二硫代氨基甲酸酯盐类经硫酸二甲酯甲基衍生化后用QuEChERS提取和净化，利用高效液相色谱串联质谱在多反应离子监测模式下进行检测。以碎片离子对m/z241/117为定性离子对、以m/z241/193为定量离子对外标法进行定量分析。标准曲线线性方程为：y=31.56x-202.6，r=0.9924，其线性范围在0.005～5.000mg/kg之间。回收率为（85.4～96.7）%，相对偏差小于10%（n=5）。本方法简便、快速、准确，可用于苹果样品中乙基二硫代氨基甲酸酯盐类杀菌剂农药残留的检测。

关键词液相色谱质谱联用法；QuEChERS法；乙基二硫代氨基甲酸酯盐类；苹果

1 前言

乙基二硫代氨基甲酸酯盐类俗名：代森锰锌，主要应用于防治果树、蔬菜、花卉及其它经济作物中藻菌纲和半知菌类引起的霜霉病、斑病、赤霉病等。由于它的应用十分广泛，并且主要杂质和分解产物乙基硫脲具有致癌、致畸、致突变作用，因此引起广泛关注。

QuEChERS法具有快速、简单、廉价、有效、可靠、安全等的特点，其技术核心是在样品的提取液中加入除水剂和杂质吸附剂，提取液经离子分离后用液相色谱串联质谱联用来分析。

本文讲述了苹果中乙基二硫代氨基甲酸酯盐类杀菌剂农药残留的检测方法。乙基二硫代氨基甲酸酯盐类经硫酸二甲酯发生甲基衍生化反应后，其衍生化反应产物采用QuEChERS法提取和净化，利用高效液相色谱串联质谱在多反应离子监测模式下进行检测。

2 实验部分

2.1主要仪器与试剂：Agilent6460三重串联四极杆液质联用仪；Waters公司生产的1.7μm粒径的BEH-C18柱；涡旋混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；台式离心机（上海仪器总厂）；高速均浆分散机（江苏康健医疗用品有限公司）；超纯水；乙基二硫代氨基甲酸酯盐类标准品（色谱纯）；分散净化剂N-丙基乙二胺（PSA，安捷伦科技有限公司）；L-半胱氨酸酸盐（分析纯，上海国药集团）；硫酸二甲酯（分析纯，上海国药集团）；EDTA（分析纯）；无水硫酸镁（分析纯）；氯化钠（分析纯）。

乙基二硫代氨基甲酸酯盐类标准工作液的制备：准确称取乙基二硫代氨基甲酸酯盐类2.9mg，用超纯水稀释并定容到500mL，制成5mg/kg的标准储备液，于冰箱中保存。移取适量的标准储备液，配制成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0mg/kg标准工作液。

2.2 样品前处理

准确称取切碎均质良好的样品10g于50mL具塞离心管中，加入0.1g L-半胱氨酸酸盐和5mL蒸馏水涡旋振荡5min；加入0.5g EDTA和0.05mg/kg的硫酸二甲酯乙腈液10mL匀浆提取5min，再涡旋振荡5min，静置15 min后，加入1.5g无水硫酸镁和0.5g氯化钠,剧烈振荡1min后，离心分离，取1mL上清液转入已加有25mgN-丙基乙二胺（PSA）、150mg无水硫酸镁的1.5mL3810型微量离心管中,涡旋离心分离后,取上清液过0.22μm有机系滤膜,待测。

2.3 色谱与质谱条件

色谱条件：BEH-C18柱；柱温:45度；流动相0.5%甲酸水溶液（pH约为2.0）/乙腈。梯度洗脱:0～0.5 min，10%0.5%甲酸水溶液；0.5～1.5 min，10%～90%0.5%甲酸水溶液；1.5～2.0 min，90%0.5%甲酸水溶液；2.0～4.0 min，90%～10%0.5%甲酸水溶液。流速:0.5mL/min；进样量:10μL。

质谱条件：大气压化学电离APCI（+）方式扫描；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：150℃；碰撞能量：10V；去溶剂温度：500℃；去溶剂气流量：N2，800L/h；锥孔电压：15V；碰撞气为氩气。定性离子对m/z241/117、定量离子对m/z241/193。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理

3.1.1 样品量的确定：样品前处理过程中有机试剂的消耗量取决于取样量的大小。使用灵敏度低的仪器分析样品中的存在的痕量待测物时，通常需要转溶和浓缩等方法将待测物富集。但是QuEChERS法在整个操作过程中，为了减少误差，实现简便、快速的目的，不需要通过溶剂蒸发和提取液浓缩等步骤对目标分析物进行分析。当苹果称样量为10g，提取液为20mL时，提取液既不稀释也不浓缩，亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯回收率和RSD都能满足要求，因此将样品量定为10 g。

3.1.2 提取剂的选择：丙酮、乙酸乙酯和乙腈等是农药残留分析中常用的提取溶剂。丙酮作为提取剂时容易提取样品中的色素等杂质，并且丙酮与水互溶，不使用非极性溶剂难以实现丙酮与水的分离。乙酸乙酯与水基本不互溶，但是用其进行提取时大部分极性农药不能转移到有机相中，为了提高亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯的回收率，必须加大除水剂的用量，而且乙酸乙酯容易提取基质中的蜡质、脂肪等非极性共提取物质。

与丙酮和乙酸乙酯相比，乙腈更容易去除样品中的水分，实现液液分层。而且脂肪在乙腈中的溶解度较低，萃取过程更有选择性。样品经不同萃取剂提取后的净化效果见下图1。故本实验选用乙腈作为提取液。

图1 样品经不同提取剂提取后的净化效果比较

3.1.3 除水剂用量

样品经液液提取后，其中的亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯被分配到有机溶剂层中。乙腈微溶于水，有机溶剂层中残留的水分会影响后续操作。加入氯化钠有利于水相和有机相分层。在农药残留分析中，硫酸钠与硫酸镁作为除水剂去除样品中的水分。与硫酸钠相比，硫酸镁的除水能力更强（是同质量硫酸钠的4倍）。因此本实验选择无水硫酸镁来除去样品中的水分。

本实验通过不同硫酸镁用量对亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯回收率的影响。观察图2（从左到右硫酸镁用量依次为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5g）中基质、有机溶剂相和除水剂的分层情况可以看出，硫酸镁用量为0.6g时，有相当多的水分残留，硫酸镁用量为0.9g时，有少量水相残留，当硫酸镁用量大于1.5g时除水剂明显过量，通过肉眼观察可知，硫酸镁用量在1.2g和1.5g时除水效果较好，并且试剂浪费量较小。另外,当硫酸镁用量过高量，由于果汁中水分较多，加入到提取液中会迅速与水结合，产生大量的热量，局部温度迅速上升，使亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯受热分解。综合上述：硫酸镁用量、氯化钠、乙腈的最佳配比为3：1：20。

图2 不同硫酸镁用量除水效果比较

3.2 色谱条件选择

本方法采用了Waters公司生产的1.7μm粒径的BEH-C18柱，具有极高的分离效率，能够在较宽的pH范围内使用。通过比较纯水、0.1%甲酸、0.3%甲酸和0.5%甲酸作为流动相的分离效果，实现发现降低pH有利于改善亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯的峰形，减小峰展宽和脱尾，因此，实验最终确定0.5%甲酸水溶液（pH约为2.0）/乙腈为流动相。

3.3 衍生化

本实验在加入抗氧化剂L-半胱氨酸酸盐条件下，乙基二硫代氨基甲酸酯盐类与EDTA反应转化成乙基二硫代氨基甲酸酯钠，后者再与硫酸二甲酯发生甲基化反应，得到甲基化衍生产物亚乙基-1,2－双二硫代氨基甲酸甲酯，在大气压化学电离APCI（+）方式下进行全扫描（m/z60～350），获得其[M+1]峰（m/z241）为母离子（图3）。通过进一步优化二级质谱参数，分别获得定性离子对m/z241/117和定量离子对m/z241/193（图4）。

3.4 方法的线性方程、回收率及精密度

将乙基二硫代氨基甲酸酯盐类0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0mg/kg标准工作液按2.3条件进行分析，以乙基二硫代氨基甲酸酯盐类的浓度为横坐标，以它对应的峰面积为纵坐标工作曲线得：y=31.56x-202.6，r=0.9924，其线性范围在0.005～5.000mg/kg之间。在苹果空白样品中分别准确加入0.05、0.1、0.5、5.0mg/kg标准工作液1mL于10g样品中，按照2.3中所述步骤进行提取、衍生化、净化及测定，结果见表1。由表1可知：回收率为（85.4～96.7）%，相对偏差小于10%（n=5）。

表1 乙基二硫代氨基甲酸酯盐类在苹果样品中的添加回收率

添加水平 / mg.kg^-1 回收率/ （%, n=5）相对标准偏差RSD / %（n=5）
0.005 90.2 9.2
0.01 96.7 7.4
0.05 92.1 6.3
0.5 85.4 8.5

3.5 实际苹果样品的测定

将从超市购买来的苹果样品按上述所讲的方法进行检测，得该样品苹果中含有0.2mg/kg的乙基二硫代氨基甲酸酯盐类农药残留量。