武汉大学分子遗传学 第六章

生物芯片技术的原理与应用

美国加州旧金山Affymetrix公司Fodor等从固相支持物上合成多肽中得到启发，灵活运用了照相平板印刷、计算机、半导体、激光共聚焦扫描、寡核苷酸合成、荧光标记、DNA分子杂交及分子生物学的其他技术研制成功丁世界上第一块DNA芯片。随后又酝酿了蛋白芯片、芯片实验室。生物芯片的出现充分体现了生物学技术与其他学科和技术的相互交叉和渗透。生物芯片技术是融微电子学、生命科学、物理学于一体的一项崭新技术，它使一些传统的生物学研究实验能在非常小的空间范围(指甲盖大小-“随身听”大小)内，以非常快的速度(几小时就可将一个人的不正常基因检测出来)完成。随着生物学技术的飞速发展，该技术越来越显示出巨大的潜力和诱人的前景。

1、生物芯片技术的基本原理

生物芯片中最早实现商品化的是DNA芯片。DNA芯片技术利用DNA分子可以变性、杂交的特性，通过DNA芯片上固定的探针或样品DNA与游离的样品DNA或探针杂交来推断未知的靶分子。杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。蛋白芯片是生物芯片中极有挖掘潜力的一种芯片。它利用蛋白质分子间的亲和作用，检测样品中存在的特异蛋白。可在医学上应用的免疫芯片即是将抗体固定在芯片表面制备而成。但最理想的生物芯片是芯片实验室，它是一种微型化、无污染、全功能的“实验室”，包含了运算电路、显示器、检测以及控制系统，在“随身听”大小的一间“实验室”里可一次性完成芯片制备、样品处理、靶分子和探针分子杂交／亲和，以及信号检测、分析。

2、生物芯片的制备

生物芯片的制备利用了微阵列技术将成千上万的生物讯息密码集中到小块玻片、硅片等固相载体上组成密集分子阵列。下面以DNA芯片的制备为例，介绍生物芯片制备过程。

DNA芯片的制备。即在控制条件下将大量DNA分子有规则地排列到载体上，是DNA芯片技术应用的前提和关键。制备方法因DNA芯片种类不同而有异，大致可分为两类：一是原位合成法，即按预先设计的序列顺序有规律地在固相支持物上直接合成成千上万种不同的DNA片段，该法适用于寡核苷酸探针的合成；二是交联制备法，即利用由电脑控制的点样装置将预先合成或制备的探针、cDNA、基因组DNA等按一定的排列顺序点在经特殊处理的载体上，通过共价交联或非共价吸附固定核酸分子，诙法主要用于中、低密度芯片的制备，既适用于大片段的DNA，也适用于小分子的寡核苷酸。

原位合成法是目前制备高密寡桉苷酸芯片景为成功的方法，主要有光控合成和标准试剂合成两种途径。原位光控合成技术由Affymetrix公司开发，它应用了固相化学、光敏保护及光刻技术，合成排列规则、种类丰富多样的寡核昔酸阵列。该法中，利用光敏保护基保护核苷酸的5\'羟基，光照射使之脱保护，DNA的合成只发生在脱去保护基的地方，光照的区域即为合成的区域，合成过程可由一系列光刻掩膜或“面具”(mask)控制(如图1所示)。

标准试剂合成原理与喷墨打印相似，喷印头根据芯片上不同部位探针序列的需要，将特定的碱基喷印到芯片的相应位置。

交联制备法根据排列设计，在固相表面点上不同的特测核酸分子或探针，利用它们与载体的交联将其固定在芯片上。点样可采用手工或自动方式，中、高密度芯片的制备须使用自动点样仪，目前自动点样仪速度可达2000单元／秒。

cDNA芯片的制备主要是利用cDNA与载体的共价交联或静电作用的非共价吸附，可采用多阳离子聚赖氨酸包被方法进行静电固定或紫外线照射等产生共价交联。寡核苷酸与蓑体表面的交联以共价方式为主，寡核苷酸合成时需引入交联的活化基团。交联制备法有较为明显的优点，制备方式直接，不需原位合成那样复杂的技术；点样的样品可事先纯化；交联的方式多样．可方便地设计、制备符合需要的DNA芯片。但制备过程中样品用量大、浪费也较严重。

3、生物芯片技术的应用

生物芯片技术可在许多领境内应用，有些已成熟，有些则还处于探索阶段。本文以DNA芯片技术的几个较为成熟的应用为例，简要介绍生物芯片技术在分于生物学、医学等领域内的应用。

3.1 DNA测序

十几年前就已提出利用DNA；S片进行DNA测序。其依据是杂交测序原理，短的标记寡核苷酸探针(一般为18-50个核苷酸)与靶DNA杂交，计算机扫描分析杂交谱，从而重建靶DNA序列。带荧光标记的目标DNA与芯片上的探针杂交后，经检测器及处理器分析处理就可得出靶DNA序列(如图2所示)，一次可测定较长片段的DNA序列。DNA芯片技术具有快速、准确等特点，应用该技术进行杂交测序有其他方法无可比拟的优越性。Murk Chee等利用这种方法确证性地对人类线粒体基因组测序，证明其准确率达99％。

3.2 基因诊断

已知人类有6000多种疾病与基因有关，所以基因诊断，特别是致病基因如癌基因、肿瘤基因等的诊断对人类的健康和发展至关重要。DNA芯片可用于大规模筛查由点突变、插入及缺失等基因突变引起的疾病(如图3所示)。用于基因诊断的芯片一般是针对靶基因而特别设计的。利用分子杂交进行特定基因的确认。

3.3 基因表达研究

为了阐明基因有序表达的调节机制，需要研究各种外界因素控制条件下的基因表达，井对单个细胞的表达进行检测。转录水平的变化能灵敏地反映细胞表达状态，如细胞类型、所处阶段及反应敏感性等。DNA芯片芯片可直接检测，mRNA的种类及其丰富度，该技术的快速发展和完善为mRNA水平研究的最终实现提供了可能性，是研究基因表达的有力工具。寡核苷酸芯片和cDNA芯片各具特点，它们都可用于转录物的检测。

已知人类有10万个左右基因，通过直接测序等手段来了解功能基因的情况非常费时费力，而改用功能基因转录出来的mRNA与芯片杂交来研究功能基因的表达，用一块芯片就可检测全部人类基因转录产物，进而研究基因表达。另外，黑色素瘤细胞系UACC-903表达基因的检测试验结果证明，利用DNA芯片技术研究基因表达与orthern杂交结果非常一致。

3.4 后基因组研究

1996年完成了第一个真核生物酵母基因组的DNA测序；1998年底完成了第一个多细胞生物线虫基因组测序；1999年，英、美和日本的研究人员绘制出了人类22号染色体的蛋白编码基因完整序列，2000年初，人类21号染色体的基因序列也被完全测序；2000年6月26日，美国、英国、法国、德国、中国等国科学家共同宣布，绘制完成了人类基因组草图。研究的工作重点从基因结构方面的研究转向基因组功能的研究，标志着人类已进入了基因组测序完成后进行未知基因功能研究的后基因组时代。

人类基因组计划(HGP)正在以超过原定速度的进展实施，预计人类基因组的全序列测定能提前两年于2003年完成，到时，能在同一时刻检测上万乃至几万个基因功能的DNA芯片更被人们关注。

3.5芯片实验宣的应用

芯片实验室可防止污染，使分析过程自动化，能大大提高分析速度和多样品分析能力，而且设备体积小，便于携带。

相信不久的将来，各种芯片实验室将不断涌现，利用芯片实验室将在生命科学、医学、食品检验防疫等方面不断取得突破。

4、应用前景

尽管生物芯片技术还处于萌芽期，但在国内也已经引起了足够的重视，由于其巨大的分析能力，极少的样品用量，简便、快速、高效的使用方式，未来的生物学研究越来越可能在生物芯片上进行。这种趋势表明许多基于囊胶和薄膜的方法将最终让位给生物芯片。

生物芯片技术的应用前景是乐观的。随着大量基因序列的确定，生物芯片技术为生物内部的生命信息的处理和应用提供了可靠的手段，对推动农业、人口、健康和环境等核心问题将发挥重大的作用。国外生命科学界、工业界和医学界等都认为生物芯片将会给21世纪整个人类生活带来一场“革命”。现在，又开发了几种新的生物芯片，如材料芯片、药材芯片等生物芯片