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Genecolour 荧光染料-EB完美替代品

分析化学



  • EB

    溴化乙锭Ethidium bromide)、是一种高度灵敏的荧光染色剂,用于观察琼脂糖agarose)和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号,可用Polaroid 底片或带CCD成像头的凝胶成像处理系统拍摄。   观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中,大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸收302nm366nm的光辐射。这两种情况下,被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭(0.5ug/ml)时,可以检测到少至10ngDNA条带。   溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸(DNARNA)。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率也相对较低。事实上,大多数对单链DNARNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。   尽管在该染料存在的情况下,线状DNA的电泳迁移率约降低15%,因此,当需要知道DNA片段的准确大小(如DNA限制酶酶切图谱的鉴定),凝胶应该在无EB情况下电泳,电泳结束后用EB染色。染色完毕后,通常不需要脱色。但是在检测小量DNA(小于10ng)片段时,通常要将染色后的凝胶进行脱色。

    损害

      溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性!   SYBR Green I溴化乙啶EBAmes 测试结果显示EB容易引起有机体突变。(Singer et al., Mutat. Res. 199, 439: 37- 47.)

    Genecolour I核酸染料特点

    无毒性:Genecolour I 独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内,艾姆斯氏试验果也表明,该染料的诱变性远远小于EB

    灵敏度高:适用于各种大小片段的电泳染色,对核酸迁移的影响小于SYBR Green I

    稳定性高: 适用于使用微波或其它加热方法制备琼脂糖凝胶;室温下在酸或碱缓冲液中极其定,耐光性强。

    信噪比高:样品荧光信号强,背景信号低。

    操作简单:与 EB 一样,在预制胶和电泳过程中染料不降解;而电泳后染色过程也只需30 分钟且无需脱色或冲洗 ,即可直接用紫外凝胶透射仪观察。

    适用范围广:可选择电泳前染色(胶染法)或电泳后染色(泡染法);适用于琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳;可用于 dsDNAssDNA RNA 染色。

    EB有相同的光谱特性,无需改变滤光片及观察装置:标准的 EB 滤光片或 SYBR 滤光片都适用,使用与观察EB相同的普通紫外凝胶透射仪观察即可,300nm 紫外光附近可得到最佳激发。但是Genecolour I不能被488 nm氩离子激光器或相似波长的可见光完全激发,因此不推荐使用此类激发装置的成像系统。对于此类装置,我们推荐您使用Genecolour IICat# 011012),它和SYBR Green I的光谱相似,灵敏度相当,但更加稳定。

    GENECOLOUR使用方法简介

    1.胶染法(用法同EB(推荐方法)

    1) 制胶时加入Genecolour I核酸染料(例如:50mL 琼脂糖溶液中加入5μL Genecolour I10,000× 液,

    以此比例类推)。

    2) 按照常规方法进行电泳。

    注意事项:

    u 此方法染色染料用量相对较少。500 μL染料大约可以做10050mL的胶。

    u 由于Genecolour I具有良好的热稳定性,可以在热的琼脂糖溶液中直接添加,而不需要等待溶液冷却。摇晃,振荡或者翻转以保证染料充分混匀。也可以选择将Genecolour I储液加到琼脂糖粉末和电泳缓冲液中,然后用微波炉或其他常用方式加热以制备琼脂糖凝胶Genecolour I兼容所有常用的电泳缓冲溶液。

    u 如果总是看到条带弥散或分离不理想,建议使用泡染法染色以确认问题是否与染料有关。如果染色后问题依旧存在,则说明问题与染料无关,请尝试:降低琼脂糖浓度;选用更长的凝胶;延长凝胶时间以保证边缘清晰;改进上样技巧或选择泡染法染色。

    u 此方法不适合预制聚丙烯酰胺凝胶,对于聚丙烯酰胺凝胶请使用泡染法。

    2.泡染法

    1) 按照常规方法进行电泳。

    2 H2OGenecolour I 10,000× 储液稀释约3,300倍到0.1M NaCl中,制成染色液。(例如将15μL Genecolour I 10,000× 储液和5mL 1M NaCl加到45mL H2O中)。

    3 将凝胶小心地放入合适的容器中,如聚丙烯容器中。缓慢加入足量的 染色液浸没凝胶。室温振荡染色30min左右,最佳染色时间根据凝胶厚度以及琼脂糖浓度不同而略有不同。对于含3.510%丙烯酰胺的凝胶,染色时间通常介于30min1h,并随丙烯酰胺含量增加而延长。

    注意事项:

    u 用泡染法染色时,染料用量较多。单次使用的染色液可重复使用3次左右。

    u Genecolour I染色液可以大量制备,在室温下避光保存直至用完。
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  • genebio

    第1楼2012/02/06

    为什么总是乱码呢?

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    +关注 私聊
  • 平凡人

    第2楼2012/02/06

    可能是格式不对,先把内容贴到写字板里。再重新复制。

    genebio(genebio) 发表:为什么总是乱码呢?

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