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CNW Athena C18-wp液相色谱柱对新型瘦肉精-苯乙醇胺A的分离

vcningmeng

2012/02/29

兽药/抗生素检测

新型瘦肉精苯乙醇胺A，属于β-激动剂的一种，具有同瘦肉精（莱克多巴胺、克伦特罗等）相同的作用和效果。苯乙醇胺A已被农业部第1519号公告列为禁止在饲料和动物饮水中使用的物质。

中文名：苯乙醇胺A(CDDM-A1108010-10mg)

英文名：2-(4-(nitrophenyl)butan-2-ylamino)-1-(4-methoxyphenyl)ethanol

化学命名：2-[4-（4-硝基苯基）丁基-2-基氨基]-1-（4-甲氧基苯基）乙醇

分子式：C19H24N2O4

分子量：344.17

目前主要以高效液相色谱串联质谱法（LC-MS）对该物质进行检测（农业部1486号公告-1-2010），我公司针对HPLC用户开发了苯乙醇胺A高效液相色谱（HPLC-UV）检测方法，同时对现有的LC-MS法进行了调整！

一．样品前处理

1. 饲料基质：准确称取1g（精确到0.001g）样品于50mL离心管，加入甲醇10mL，漩涡混合30s后超声提取20min（期间再漩涡2次，每次10s），4000r/min离心8min，取上清液过CNW Poly-Sery MCX混合型阳离子交换SPE小柱（MCX小柱预先用3mL甲醇、3mL水活化），用3mL水、3mL甲醇依次淋洗，近干后用3mL5%氨水甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。将洗脱液于50℃氮吹至干，用甲醇定容至1mL，过0.22μm有机滤膜，上机分析。

2. 猪肉基质：准确称取1g（精确到0.001g）样品于50mL离心管，加入0.2mol/L乙酸钠缓冲液（乙酸调pH约5）8mL，充分漩涡混合，再加入50μLβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，充分漩涡混合后于37℃恒温箱酶解12h。4000r/min离心15min，取上清液加入0.1mol/L高氯酸3mL，漩涡混合均匀后用高氯酸调pH约1，4000r/min离心15min后将上清液转移到50mL离心管中，用10mol/L 氢氧化钠溶液调pH约11。加入饱和氯化钠溶液10mL和甲醇10mL，漩涡混合30s后超声提取20min（期间再漩涡2次，每次10s），4000r/min离心8min，取上层有机相过CNW Poly-Sery MCX混合型阳离子交换SPE小柱，后续步骤同饲料基质。

二．HPLC分析方法

1.HPLC色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18-WP，2.1×150mm,3um（LAEQ-211573）

柱温：25℃

流动相：0.01%二乙胺水溶液（pH7.8）：乙腈=60:40

流速：0.2mL/min

进样量：10μL

检测器波长：UV 226nm

2.苯乙醇胺A标准曲线(CDDM-A1108010-10mg)

配制0.1ppm,0.2ppm.0.5ppm.1.0ppm苯乙醇胺A标准溶液，依次上HPLC分析，得到浓度和峰面积的标准曲线如下：

苯乙醇胺A浓度与峰面积在0.1ppm~1.0ppm范围内线性良好，标准曲线方程Y=101632X+0，相关系数1.0000！

饲料基质加标0.1ppm,0.2ppm,0.6ppm回收率在81%-104%

猪肉基质加标0.1ppm,0.2ppm,0.6ppm回收率在78%-105%,

三．LC-MS分析方法

1.LC-MS色谱及质谱条件

色谱柱：CNW Athena C18-WP，2.1×150mm,3um（LAEQ-211573）

柱温：25℃

流动相：0.01%二乙胺水溶液（pH7.8）：乙腈=40:60

流速：0.2mL/min

进样量：10μL

离子源：电喷雾离子源

扫描方式：正离子扫描

检测方式：选择反应监测SRM

2.分析图谱

I．苯乙醇胺A标准溶液（0.01ppm）色谱图

组分保留时间（min）峰面积

苯乙醇胺A 7.24 1356

II．苯乙醇胺A标准溶液（0.01ppm）全扫描质谱图

III．苯乙醇胺A标准溶液（0.01ppm）母离子（m/z 345）二级子离子扫描质谱图

IV. 饲料中0.01ppm苯乙醇胺A加标

组分保留时间（min）峰面积

苯乙醇胺A 7.25 1188

V. 猪肉中0.01ppm苯乙醇胺A加标

组分保留时间（min）峰面积

苯乙醇胺A 7.37 1359

3.苯乙醇胺A标准曲线

配制0.01ppm,0.02ppm.0.05ppm.0.10ppm苯乙醇胺A标准溶液，依次上LC-MS分析，得到浓度和峰面积的标准曲线如下：

苯乙醇胺A浓度与峰面积在0.01ppm~0.1ppm范围内线性良好，标准曲线方程Y=110154X+155.25，相关系数0.9977！

饲料基质加标0.01ppm,0.02ppm,0.06ppm回收率在94%-118%

猪肉基质加标0.01ppm,0.02ppm,0.06ppm回收率在106%-109%

讨论: 农业部1486号公告-1-2010中所用LC-MS方法用的是甲酸调节PH值，上质谱，从实验结果来看，应该是有问题的，如果用甲酸调节PH以后，苯乙醇胺A全部质子化，在C18上面是没有保留的；实验过程也证实的确是这样。所以在实验过程中，我们调整了实验方法，改用二乙胺调节PH值。

分
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qzxmsy

第1楼2015/03/30

应助达人

很好的一篇文献，可能试试看

0

hujiangtao

第2楼2015/04/08

应助达人

嗯，有些方法很怀疑他们是怎么通过的

0

zjn1123

第3楼2015/04/09

应助达人

你除了流动相用二乙胺之外其他过程和农业部1025号公告β-受体激动剂的检测方法是一样的，我这有几点疑问，
苯乙醇胺A是弱碱性化合物，也就是得用ESI+离子扫描，那么你用二乙胺将流动相调到7.8会抑制化合物离子化，虽然增强了在C18柱上的保留，但是降低了ESI+模式的离子化效率，降低了其灵敏度，在我看来，像苯乙醇胺A这样禁用的药物，检出限是做到越低越好，而且，苯乙醇胺A就算在酸性环境下其非极性基团在C18上还是有保留的，我们做着没有问题。

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