DNA测序问题大汇总

Q：为什么我在测序报告上找不到我的引物序列？

A：这里分两种情况。
一是找不到测序使用的引物序列。这是正常的，因为荧光测序方法采用的是荧光标记了的ddNTP，自动测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列。由于引物本身是不被标记的，所以在测序报告中也是找不到的。
二是找不到克隆片段的扩增引物。发生这种情况原因可能是您在构建质粒时采用的工具酶的酶切位点距离您的测序引物太近，由于荧光染料的干扰在序列开始的部分会不十分准确。比如pBluescript II KS这个质粒如果采用Sac I做工具酶，采用T7引物测序，
taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca
M13 forward T7 Sac I
那么从T7引物末端到 Sac I的酶切位点只有6个bp，这样酶切位点后的扩增引物序列在测序报告上很可能不完整。解决的办法是采用M13 forward引物来测序，这样可以保证Sac I的位点和之后的引物序列都可以完整的出现在报告中。还有一种可能是您的插入片段的插入方向是反的，这时您不妨找一下您引物的互补序列。

Q：我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测？

A：我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置，如果从测序报告上的确无法作出准确判读，我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确，您仍然要求再进行一次实验，那么实验原则和验证实验是相同的。

Q：样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么你给我的测序结果是一个空质粒？

A：由于测序的方法目前还属于费用比较高的鉴定方法，所以我们相信客户在送样品前都是已经鉴定过的。但是我们由于条件的限制，无法单独的对某一个客户的样品进行特定条件的培养，所以可能在培养过程中发生插入片段的丢失。
由于这种情况的发生无法事先预期到，所以我们也只能对出现这样情况的客户说抱歉。直接提供质粒虽然可以避免这样的情况，但由于质粒制备上的问题，测序的成功率可能会受到影响。

Q：你们给我的序列怎么在一串A/G/C/T后就没有信号了？

A：重复序列的测定是目前荧光测序方法的一个局限。
我们目前的原则是对于质粒DNA(闭合双链)上当存在30个以上的polyT/A时无论之后的信号质量如何，我们都会将报告发出，在PCR模板上这个限制的长度为15个碱基。相对A和T，G/C的影响更大一些，无论在何种模板上只要出现连续10个的G或C，不管之后的信号质量如何，我们都会将报告发出。由于这样的重复序列对测序结果的影响是绝对的，所以还请测序客户在选择引物时尽量避开有重复序列的一端。这样的报告收取50%的费用。

Q：你们给我的结果上怎么有这么多的错误！明明这里有一个A/G/C/T为什么没有读出来？

A：您会完全相信测序的结果吗？我不会相信。我只相信多次测序累加后的结果。通常情况下测序报告的前端30个碱基由于会受到荧光染料的干扰，可能会存在错误，为保证您能够得到完整的目的序列，请您在选择测序引物时务必谨慎；序列的可靠程度视图谱峰型的质量而定，我们通常提供500个有效碱基；自动测序仪解读序列的准确性达到99%以上，虽经过我们技术人员的检查，还是有可能会有错读和漏读的情况发生，要达到100%的准确性只有进行不同方向的多次测序。
还有一种情况是样品中某一段GC含量很高，如果使用常规试剂在这里往往会发生信号的中断，而有这样一种试剂盒是专门针对这一类情况的，它可以使信号通过GC Rich的区域，但同时带来的副作用是在GC Rich的区域会出现GC信号的压缩和错位。这就需要从另外的方向再进行测序来效验。这样的报告收取50%的费用。
未使用GC Rich 试剂时的情况

使用GC Rich 试剂后的情况，注意136位碱基处出现压缩


Q：我要求5'到3'正向测序，为什么你们给我的序列是反的？

A：您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3'引物和5'引物这样的字样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7，T3，SP6，M13f，M13r这样的形式来填写，或注明酶切位点方向比如"测序方向EcoRI到HindIII"。我们手中等质粒资料有限，有有时还需要您提供质粒的相关资料。

Q：我的样品你们已经测通了，但为什么在overlap区有这么多的错配，给出的全序列和单个报告也称作差异，我该相信谁？

A：给出的全序列是一个拼接的结果，当互相拼接的两个序列存在差异时，应该以序列质量更好的应该为主，这也就是为什么会出现错配和全序列与单个测序结果的差异。

Q：你们总提到two pattern，什么是Two Pattern?

A：下面的图谱就是一个典型的two pattern 的结果。

从图中可以看到在同一个碱基的位置上出现两个不同的峰形，这样的结果就是two pattern。导致这种结果的原因是：
一. 样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形。
二. 样品不是单一模板，这常常发生在样品为PCR产物的情况中。由于使用的是特异性引物，因此即使模板中有其他DNA的存在，产生干扰的可能性也很小。通常是由于存在两条分子量很接近，采用琼脂糖电泳无法分开的条带，在测序时就会发生这种情况。
三. 样品中存在两个引物结合位点，这常常发生在样品中存在重复序列的情况下。当引物恰好设计在重复序列中时，那么在重复序列以外的部分就会出现Two pattern 的情况。

Q：这个问题肯定是你们的责任。我在你们这里合成了引物，用该引物扩增得到所需片段，构建克隆后又你们这里进行的测序，结果发现引物区少/错了一个碱基。你们要赔偿我的损失！
A：请看下面两个图


这是一批实验中的不同克隆，正常引物序列应该是在GAATTC位点后以CGATGT开头，但上面一个克隆明显在5'端缺少了一个C。
举这样一个例子主要是想说明在引物区同样存在错配的可能。当然出现这样的情况后关键是如何明确问题的所在。比较简单的方法是再挑选一个同批次的克隆进行测序。因为如果是PCR错配引起的这种错误，那么必然是一个小概率事件，其联系出现于两个克隆上的几率就更是微乎其微。而如果是引物上的问题，那么同样问题联系出现的概率就大很多。所以新德克隆如果测序后发现问题依旧，那么引物合成错误的可能更大，反之则是PCR过程出现问题的可能更大。

1、PCR 产物测序时出现重叠峰

问题图1【模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码】

图1-1



解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）



解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

图3



测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'''端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的峰形重叠。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化。



2、克隆测序时出现峰形重叠



原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中含有两种以上插入片段不同的质粒；或是是送测序的菌液污染。

解决方法：重新挑单克隆的菌落（划线分离单菌落），提质粒或送菌液再次测序。

3、样品有杂合/突变位点



模板中有杂合型突变，也就说模板本身在这个位点出现突变；或者是从基因组中扩增出来的杂合位点。如果模板有杂合（突变或缺失），那么测序图形中其他的位点一般都是单一的峰形，然后突然在某一个位点出现重叠峰（如图中箭头所示）。

解决方法：建议将DNA片段克隆到载体再测序。

4、polyA/T 和C/G cluste导致的套峰和测序信号衰减



RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序；但如果这样的序列出现在中间，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

C/G cluster在PrV基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa公司给解决了，虽然不喜欢鬼子，但有时候却不得不用它们的产品和服务。

5、基因中含有重复序列



可能的原因：样品中含有重復序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的重復序列会导致测序结果出现移码；而较长的重復序列会使定序信号衰减。

解决办法：反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。

DNA测序的基本原理及准备样品时的注意事项


来源：互联网


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