蛋白水解液中多肽的测定色谱峰异常？

多肽分离是不是要用凝胶柱？

可不可以尝试一下改变溶液浓度

有水有渝(xky0230699) 发表:一，蛋白水解液前处理：

取适量约（1ml）蛋白水解液置5mL离心管，加水1ml稀释后加入15%三氯乙酸溶液1ml，乙腈5滴，振摇5min后静置10min（尽量使蛋白质沉淀完全）。离心15min，吸取上清液3d，用0.1%的磷酸溶液稀释至约2.5ml,摇匀。过0.22um滤膜。

二，色谱条件：

流动相：A泵 0.1%磷酸溶液；

B泵 0.1%磷酸溶液－乙腈（80%∶20%）；
梯度洗脱


检测波长：λ1＝215nm λ2＝280nm ；

流速： 1.0ml/min ；

柱温： 30℃ ；

进样量：20ul ；



峰形如此，感觉是输送机很多峰没有分离开，大家觉得分析方法哪里可以改进？

应助达人

已补充说明使用的是C18柱，已用TCA沉淀大部分的蛋白质。15-20min这一段完全没有要分离的迹象，如果再降低有机相比例，那分析时间太长。

柱子的柱效高吗？是5um的填料吗？其次，你进样浓度大概是多是，是否过载，此图有点像过载的样子！ 或试一下其他的酸吧（TFA，AcOH等），建议A和B中都加一定比例的乙腈！

应助达人

TFA还在购买中，由于检测波长选择为215nm，不适合使用AcOH，样品浓度无法估计，因为没有对照品，实际情况是这个多肽的组成成分完全不知道。

蛋白水解液能分成啥样，看许多柱子公司自己发的BSA水解液，都是上百个峰，建议用TFA试试吧，还有就是C18的柱子选择300A孔径，对分离效果应该有好处！
梯度也可以适当调整下吧，前面峰密度大，缓一点，后面峰少就陡一点喽，呵呵，纯属纸上谈兵哈，几年前做过水解蛋白的纯化，痛苦的经历……

应助达人

小分子量多肽可以用反相柱，大分子和蛋白质要用凝胶柱。

上次的分析图，分析方法相同，反应液反应时间较短

梯度应该还能优化

优化梯度，一般水解多肽我们用离线二维色谱分离