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第1楼2012/05/15
6. 血清之沈淀物
6.1. 凝絮物:发生之原因有许多种,但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成,这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物,可用离心3000 rpm, 5 min 去除,或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物,因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”:通常经过热处理之血清,沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”,常会误认为血清遭受污染,而将血清放在37 oC 中欲培养此“微生物“,但在37 oC 环境下,又会使此沈淀物增多,更会误认为微生物之增殖,但以培养细菌之培养基检测,又没有污染。一般而言,此小黑点应不会影响细胞之生长,但若怀疑此血清之品质,应立即停用,更换另一批号的血清。
7. 血清之生长测试
7.1. 材料:
7.1.1. MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
7.1.2. a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
7.1.3. 6-well TC plate (or 35mm TC dish)
7.1.4. methanol
7.1.5. glacial acetic acid
7.1.6. 10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
7.2. 步骤:
7.2.1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。
7.2.2. 以trypsin-EDTA 处理细胞,离心后,加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液,并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102 活细胞数/ ml。
7.2.3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中,并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM,使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
7.2.4. 37 oC,5 % CO2 培养箱培养5-7 天,期间不需更换培养基,待细胞群落大到可以肉眼观察,而群落间不互相接触即可。
7.2.5. 去除培养基,加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),室温下静置10 min。
7.2.6. 去除固定液,水洗二次。
7.2.7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution,,室温下静置染色2-3 min。
7.2.8. 去除染液,水洗二次。
7.2.9. 以肉眼计数群落数
7.2.10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency ):
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
7.2.11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency):
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
7.3. 比较各浓度血清培养基之RPE,即可得知待测血清对细胞生长的影响。
7.4. 订购多量同一批号的优良血清,置于–70 oC 保存之
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冷冻细胞活化
1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。
2. 细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3. 材料
3.1 37 oC 恒温水槽
3.2 新鲜培养基
3.3 无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶
3.4 液氮或干冰容器
4. 步骤:
4.1 操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。
4.3 将新鲜培养基置于37 °C 水槽中回温,回温后喷以70 % 酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。
4.4 取出冷冻管,立即放入37 °C 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,以70 % ethanol 擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。
4.5 取出0.9 ml 解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。
4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO 或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内,离心1,000 rpm, 5 分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2 培养箱培养。
4.7 若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。
细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时,即须分殖至新的培养瓶中,一般稀释比例为1:3 至1:6,依细胞
种类而异。
2. 材料:
2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS,
GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062):
以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20 oC,使用前放在37 oC 水槽
回温。
2.3. 新鲜培养基
2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
3. 步骤:
3.1. 附着型胞(adherent cell)
3.1.1. 吸掉旧培养液。
3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 oC 作用数分钟,于倒
立显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时,吸掉trypsin-EDTA 溶
液。(若不移去trypsin-EDTA,则在trypsin-EDTA 作用后,加入适量含血清
之新鲜培养基终止trypsin 作用,离心后再吸掉上清液。)
3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养基,以吸管上下吸放数
次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常
培养条件培养。
3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。
3.2.2. 吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的
培养瓶中,以正常培养条件培养。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可
能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基
稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分殖至新培养瓶中。
细胞计数与存活测试
1. 原理:
1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。
1.2. 血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber 中细刻9 个1 mm2 大正方形,
其中4 个角落之正方形再细刻16 个小格,深度均为0.1 mm。当chamber 上方
盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时,计
数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml 中之细胞
数目。
1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细
胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料,如果细
胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。
2. 材料:
2.1. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.2. Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl
paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
2.3. 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)
2.4. 计数器(counter)
2.5. 低倍倒立显微镜
2.6. 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步骤:
3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于
1.5ml 小离心管中。
3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入,盖上盖玻片,于
100 倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin
bluish)。
3.3. 计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypan blue
等体积混合),最后乘以104 ,即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线
上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml
*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球计数盘,可用Coulter counter 作自动计数,惟无法辨别死细胞或活细
胞。
3.5. 范例:
T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液,取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan
blue 混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之
细胞数目。
活细胞数/方格:55 ,62, 49, 59
死细胞数/方格:5, 3, 4, 6
细胞总数= 243
平均细胞数/方格= 60.75
稀释倍数= 2
细胞数/ml:60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
细胞数/flask: 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率:225/243﹦92.6 %
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细胞冷冻保存
1. 注意事项:
1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态,约为80 – 90 %
致密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二
日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22 micron
FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小体积
分装,4 oC 避光保存,勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级,以高压蒸汽
灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度:
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma 会因冷冻
浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须
较高之浓度,而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106
cells/ml。
1.5. 冷冻保护剂浓度为5 或10 % DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保
存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。
1.6. 冷冻方法:
1.6.1. 传统方法: 4 oC 10 分钟---> -20 oC 30 分钟---> -80 oC 16 - 18 小时(或隔夜)
---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温:利用等速降温机以–1 ~ -3 oC/分钟之速度由室温降至–120 oC,
放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
2. 材料:
2.1. 生长良好之培养细胞
2.2. 新鲜培养基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球计数盘与盖玻片
2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)
3. 步骤:
3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基,观察细胞生长情形。
3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制):将DMSO 加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10
%,混合均匀,置于室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作,收集培养之细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细
胞浓度及冻前存活率。
3.4. 离心,去除上清液,加入适量冷冻保存溶液,使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml,混
合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1 ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污
染检测。
3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 oC 10 分钟→ -20 oC 30 分钟→ -80 oC 16~18 小
时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中,再放入液氮槽中。程序
为: program 7: HB CELL
收到细胞的处理方式
细胞活化︰
1. 收到细胞株包裹时, 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形, 若有请立即通知。细胞
株请尽速开始培养, 或立即冷冻保存(置于–70 °C, 隔夜后, 移到liq N2)。
2. 冷冻细胞解冻程序:
2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比
例, 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之
血清种类, 若因实验需要, 必须有所不同时, 务必以缓慢比例渐次改变培养
基组成, 确定细胞适应后, 方进行所需之实验。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse
serum, 马血清),对细胞而言差异极大,请务必依据细胞株资料单指定之血清种
类培养之。
2.3. 将培养基置于37 °C 水槽中回温, 回温后喷以70 % 酒精并擦拭之, 移入无
菌操作台内。取出冷冻管, 立即放入37 °C 水槽中快速解冻, 水面高度不可
接近或高过冷冻管之盖沿, 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全
部融化后, 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部, 移入无菌操作台内。
2.4. 依据细胞种类和浓度,于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask
中。取出已解冻之细胞悬浮液,缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基, 混
合均匀,放入37 °C,5 % CO2 培养箱培养。
2.5. 对绝大多数细胞而言,1 % 以下之冷冻保护剂DMSO,不会对细胞之贴附或活
化有不良影响,不需立刻由解冻细胞中去除, 待第二天确定细胞生长或贴附良
好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞,需
立即去除DMSO 者, 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中,
离心300 xg (约1000 rpm),5 分钟,小心移去上清液,加入适量新鲜培养基,
将细胞均匀混合后, 转移至培养瓶中, 再放入37 °C, 5 % CO2 培养箱培养。
收到T25 flask 细胞时, 处理方式为︰
1. 于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25 flask 均加满培养基。请检查
flask 外观,并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象,若有任何问题, 不
要打开盖子,请立即通知细胞实验室。
2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C, 5 % CO2 培养箱中,使细胞回温至37 °C, 并
让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后,于无菌操作箱内取出flask
内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5-10ml 培养基于flask 内,依
一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘, 则将细胞做传代培养。