miRNA的作用机制及功能研究进展

2 miRNA的特征及与siRNA的比较

2.1 miRNA的特征

2.1.1 结构特征 长度为~22nt是miRNA一个最基本的特征, 且具有能形成分子内茎环结构的前体。在动物中,前体的长度一般在70～90nt,而在植物中前体的长度可变性很大,可以从几十到数百nt。

2.1.2 miRNA的存在形式 miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中, 在基因组中有固定的基因座位，70％~90％位于蛋白基因的基因间隔区(intergenic region,IGR)，其余在内含子，还有个别在编码区的互补链，说明它们的转录独立于其他的基因,具有本身的转录调控机制。最近有研究^[21]发现，25%的人类已知miRNA位于蛋白质编码基因的基因内区域(intronic regions)，其中大约50%定位于内含子(introns)中,这些miRNA都具有独立的转录单元，可以作用于其主基因(host gene)的非翻译区(untranslated region，UTR)下调其蛋白质编码基因的表达水平，并且还可以作为重要的负反馈调节子。

2.1.3 保守性 miRNA不仅在结构上保守而且在物种间具有高度的进化保守。结构上，miRNA 在颈部的保守性较强，而环部可以容纳较多的突变位点的存在。种系上，有些miRNA在一些物种中是高度保守的。约12％的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比较发现，这些保守片断的碱基差异仅为1~2 nt；miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。在线虫中,发现85 %的miRNA 在C. briggsaze 基因组序列中是有同源物的^[18]。

最具有miRNA保守性的是let-7 RNA,let-7在C. elegans和人类中完全保守；大约40％的C. elegans中的miRNA在人类中也是保守的。线虫C.elegans中的let-7 miRNA可以在果蝇基因组,人的第9、11和22条染色体上各找到一个与之完全一致序列,另外在人的第9条染色体上还有一个仅差1个核苷酸的序列^[10]。

2.1.4 时空特异性 目前研究较清楚的lin-4与let-7呈时间特异性表达。在C.elegans中，lin-4只在幼虫的第一期和第二期存在;let-7却存在第三、第四期及成虫期,在第一和第二期并不存在；在拟南芥中，miR157在幼苗中高表达，miR171则在花中高表达^[23]。同时,miRNAs的表达具有组织特异性。例如，mir-290~mir-295只在鼠胚胎干细胞中表达，而在成体组织主要在胸腺和骨髓中表达^[14]。最近一项研究^[28]发现，miRNA靶目标在成熟小鼠和果蝇组织中的表达水平要比在胚胎中低，同时，miRNA更倾向于靶向广泛表达的而不是组织特异性表达的基因，这项结果表明了miRNA广泛地参与胚胎发育及成体组织特性的维持。

2.2 miRNA与siRNA的比较

miRNA与siRNA 的根本区别是他们来源不同，而二者的作用机制相通。首先，miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点: 5＇端磷酸，3＇端均有2个游离核苷酸。3. miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。4. 二者都是RISC(RNA induced silencing complex)组分，都具有组成RISC复合体的Argonaute蛋白家族，其功能界限已变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠。

miRNA和siRNA也有区别。1.根本区别是miRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。2.二者结构上没有本质区别，功能分子都是单链RNA，miRNA转录出来时必然是发夹状的，siRNA可以由完全互补的双链切断而来，也可以从发夹来。3.本质区别在于作用位点上，miRNA作用于固定的靶基因，有特定的作用位点，一般在靶基因3′-UTR区，而siRNA由于是随机产生的或者人工设计的，因此作用位点可以设计或改变，可作用于mRNA的任何部位。4.在作用方式上，没有本质区别，是否降解或翻译抑制取决于互补程度，siRNA也可抑制靶标基因的翻译。5.miRNA的生理功能在于调控发育分化和调亡，适时调节内源基因表达，而siRNA是生物抵抗外来核酸片断入侵的一种方式，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

miRNA与siRNA 的区别总结于表1^[2]。

表1 miRNA和siRNA的区别

3 miRNA的生物发生

目前，关于miRNA的生物发生的研究已经取得较大进展。动物(尤其是人) miRNA 的生物合成过程已经初步得到了诠释。miRNA的生物发生过程如图1^[4]所示。

图1 miRNA的生物发生过程

4 miRNA的作用机制

miRNA在发挥作用之前，需要同细胞内一些协同因子结合形成蛋白质- RNA复合物（miRNA-containing ribonucleoprotin，miRNP），在miRNP的作用下指导其识别同源mRNA。在Hela细胞裂解液中发现这类核糖核酸蛋白复合物的大小在15S左右，其主要成分为Germin3、Germin4和Argonaute蛋白家族成员eIF2C2因子,后两种蛋白质与运动神经元的存活(survival of motor neurons,SMN)有关^[10]。研究认为，miRNP即为RISC.

miRNA与靶mRNA作用的典型方式主要有两种(如图3，图4^[16])：

在大多数情况下(例如在动物中)，复合物中的单链miRNA 与靶mRNA的3' UTR不完全互补配对，阻断该基因的翻译过程，从而调节基因表达。这种方式只影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。目前，该翻译抑制的详细机理尚不清楚。最近有研究对此提出质疑，他们^[24]认为，正常衰退途径引起的mRNA降解速度的升高也会导致蛋白质表达水平的下降，且miRNA不仅能作用于翻译起始后的延长阶段，还能够抑制翻译的起始。被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P-bodies的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。然而，P-bodies可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，并且，减少一些特定P-body组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制。

P bodies^[13] 是胞浆中的一定区域(如图3)，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、无义介导mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay ,NMD)，转录抑制及RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。尽管P bodies不是介导基因沉默所必需的，但阻断siRNA或miRNA基因沉默途径的任何一步都会阻碍P-body的形成，这表明P-body是基因沉默的结果。因此，尽管P-body成分在mRNA沉默及衰退中起重要作用，但P-body中的这种聚集并不是介导基因沉默机制所必需的，而只能作为他们活动的结果。

图3 P bodies的作用机制

图4 miRNA的两种作用机制

5 miRNA 的功能及意义
高等真核细胞中，miRNA基因占已知基因的~1%，目前估计哺乳动物细胞中有600多个miRNA，30%的基因要受到miRNA的调节。miRNA的多样性与进化保守性决定了其在生理生化功能上的重要性与普遍性。然而只有少数miRNA的已经明确，许多miRNA的功能还尚待深入研究。表2[1]列出了几种已知功能的miRNA，现在已经认识到这类小分子miRNA在生物体发育、细胞增值与分化、激素分泌、肿瘤形成等过程中扮演者重要角色。
表2 已知功能的miRNA
miRNA名称 物种 生物学功能 靶基因
lin-4 线虫 发育时序调节 lin-14,lin-28
let-7 线虫 发育时序调节 lin-41,hbl-1
lsy-6 线虫 神经细胞化学感受器 cog-1
不对称性调节
miR-273 线虫 神经细胞化学感受器 die-1
不对称性调节
miR-165/166 拟南芥 叶子近轴与离轴细胞的分化 PHV/PHB
miR-172 拟南芥 花朵发育 APETALA2(AP2)
Bantam 果蝇 调节细胞增殖和凋亡 hid
miR-14 果蝇 调节细胞凋亡和脂类代谢 caspase Ice?

续表2
miR-15a/ 哺乳动物 B细胞慢性淋巴细胞白血病 Bcl-2
miR-16-1 （B－CLLs）
miR-196 哺乳动物 脊椎动物发育 Hox-B8
miR-143 哺乳动物 脂肪细胞分化 erk5
miR-375 哺乳动物 胰岛素分泌调节 mtpn
miR-1 哺乳动物 心脏细胞的生长和分化 Hand2
5.1 miRNA与生物体的发育分化
在动物中，针对数种模式生物(人、小鼠、果蝇、线虫)的miRNA所做的研究已经非常深入。在线虫中除了最早发现的lin-4、let-7参与线虫的形态转换,还发现两个与神经模式发生有关的miRNA:lsy-6和mir-273, 证据已经表明,lsy-6和mir-273能影响左右神经系统内某一特定化学感受器受体的水平,这部分解释了神经系统功能的非对称性[7]。另外，研究发现另一种重要的发育相关基因miR-196和靶基因Hox-B8匹配的非常完美，并导致靶mRNA的降解。
在植物中，大多数的miRNA 介导其靶mRNA的降解。植物中的miRNA与相应的靶mRNA近似完全配对，并且互补区域散布在靶mRNA的转录区域内而非仅仅局限在3' UTR，使得miRNA会结合到包括编码区域在内的多个位点上去，从而直接降解mRNA而非抑制其翻译。例如mir-172[3]，它在拟南芥的花朵发育中介导翻译抑制。与动物miRNA不同的是，mir-172的互补位点与其靶基因APETALA2(AP2)的互补位点落在编码区域而非3 'UTR。因此，植物中的miRNA功能与siRNA 的功能非常相似。
5.2 miRNA与细胞分化
在鼠骨髓、胸腺的B淋巴细胞中miR-181特异表达,参与增强哺乳动物B淋巴细胞分化， miR-181过表达引起B淋巴细胞减少,T淋巴细胞增加,但目前miR-181作用的靶mRNA还未发现。此外,有人鉴定了干细胞和已分化细胞的miRNA,发现有些miRNA是干细胞特有的,例如,小鼠干细胞特异表达miR290~295,人干细胞特异表达miR371~373,推测是维持细胞全能性所必需的并参与细胞分化过程。一些miRNA呈组织特异性表达,似乎表明它们与维持分化细胞的功能有关[7]。
近期有研究表明:miRNAs在心脏细胞的生长和分化过程中,也扮演着极为重要的平衡角色。miR-1家族包括miR-1-1和miR-1-2,在心肌、骨骼肌中特异表达, miR-1能够靶向Hand2基因的mRNA,而Hand2基因是心脏形成的一种关键调节因子, miR-1能适时关闭Hand2蛋白制造,以促使心脏正常发育[27]。因为Hand2蛋白是一种重要的调节因子，所以发现这种miR-1对控制Hand2及其他蛋白具有重要意义。
5.3 miRNA与细胞增殖和调亡
果蝇中的bantam与细胞凋亡和生长控制有关, 这是第一个被鉴定的与增殖相关的miRNA基因。bantam的靶基因hid，hid已被证实是一种调亡诱导基因，bantam与hid mRNA的3' UTR互补结合，阻止hid mRNA的翻译，抑制蛋白的表达，最终表现为促进细胞增殖的作用。相反，如果敲除bantam，hid的表达水平将上调，诱导调亡的发生，抑制细胞增殖。似乎，bantam扮演了一种癌基因的角色[1]。
Xu等在果蝇体内发现了另一种调亡抑制miRNA：miR-14，它通过调节调亡效应因子半胱天冬酶Drice而参与细胞调亡和脂肪代谢。目前还不清楚miR-14的靶基因，但发现miR-14的突变，会导致调亡效应因子caspase Ice水平的增高，这可能是miR-14的作用靶点[1，7]。
2002 年,Calin 等首先发现，miR－15a 和 miR-16-1在约65%的B细胞慢性淋巴细胞白血病（B－CLLs）病人中表达下调。随后不久，Cimmino等[15]又发现，在B－CLLs 细胞中 miR－15a和miR-16-1直接与BCL2的3′－UTR序列相互作用调控BCL2蛋白的表达，并与之成负相关，而BCL2是作为抗凋亡基因参与细胞凋亡过程的,这里miR－15a和miR-16-1发挥了类似抑癌基因的作用，而且miR－15a和miR-16-1还可能激活外源性APAF－1—胱天蛋白酶－9(caspase-9)-PARP凋亡途径，参与凋亡过程。
5.4 miRNA与激素分泌
美国洛克菲洛大学的研究人员从糖诱导的鼠胰岛β及α细胞系的RNA中克隆出大量长度为21~23个核苷酸长度的RNA，其中，miR-375含量最多，研究发现，miR-375能够抑制β细胞系分泌胰岛素，进一步研究结果表明，miR-375通过与靶基因mtpn 的mRNA3' UTR不完全互补配对，转录后水平抑制了靶蛋白的表达，从而抑制了胰岛素分泌的出胞过程[1]。这一研究发现为机体如何调节胰岛素分泌过程开辟了新路，同时也为一些疾病（如糖尿病）的治疗奠定了基础。组织特异性miRNAs，如miR-375，将可能成为一些疾病治疗药物新的作用靶点。
5.5 miRNA与肿瘤发生及治疗
近几年，miRNAs与人类肿瘤的关系逐渐引起了人们的广泛注意，并不断有肿瘤发生与miRNAs的表达有关的例子的报道。研究表明,miRNA的表达水平在许多肿瘤中发生改变,它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。
Calin 等[5]发现 miR- 15a 和 miR- 16- 1 定位于染色体 13q14, 而这一区域在一半以上的 B- CLLs 病人中缺失。而且这一缺失在约 50%的外套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL), 16%～40%的多发性骨髓瘤和 60%的前列腺癌中出现。推测他们可能起着肿瘤抑制基因的角色。随后，Calin等又惊奇地发现，超过一半的miRNA位于和肿瘤发生相关的区域和脆性位点、杂合型丢失区(minimal regions of loss of heterozygosity)、扩增区[minimal regions of amplication (minimal amplicons)]或断裂点区(common breakpoint region)。；
此外，Iorio和Michael等发现，miR-143，miR-145 在结、直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和淋巴瘤中的表达下调，这两个基因位于 5q32-33。 He等研究发现，miR-221,　-222,　-146在乳头状甲状腺癌中显著上调。Ciafre　SA和Chan 等发现，miR-21 可作为一种抗凋亡因子，在恶性胶质瘤和乳腺癌中的表达是上调的。Metzler等在儿童的Burkitt淋巴瘤中发现 miR-155/BIC 的前体高表达。Johnson　SM 等发现肺癌let-7的表达常是降低的，let-7的靶点是Ras癌基因，RAS 信号通路在哺乳动物中调控细胞的正常生长和恶性增殖, RAS 蛋白过表达会引起细胞的恶性增殖，let-7表达的降低可致其靶点癌基因Ras表达的增加和促进肿瘤生长[5，9]。
可见, miRNA 表达水平的变化, 导致了肿瘤基因或抑癌基因转录后的异常调控, 从而导致肿瘤的发生。若miRNA的靶基因是癌基因,此miRNA的表达低于正常水平,也意味着它对癌基因的抑制作用减小,引起癌基因编码的蛋白增加,导致肿瘤发生;反之,若miRNA的靶基因是抑癌基因,此miRNA的表达高于正常水平,也意味着它对抑癌基因的抑制作用增加,引起抑癌基因编码的蛋白减少,也会导致肿瘤发生[11]。从这种意义上理解,一些miRNA可能是潜在的癌基因或者抑癌基因,通过寻找具有癌基因和抑癌基因性质的miRNA,可以为肿瘤的诊断和生物治疗提供新的靶标。
许多miRNA的异常表达都与癌症或其他一些疾病有关, 最新有研究[17]发现，miRNA 成熟过程的总体抑制促进了细胞转化和肿瘤形成，但目前对调节miRNA表达的因子却知之甚少。Lee J等[19]在miRNA基因上游鉴定了大量调节元件，这些元件可能在miRNA的转录及转录后水平的调节上起重要作用。研究中他们提出了一种可能，认为一些与疾病有关的蛋白质编码基因的转录因子(transcription factors ，TFs)导致了疾病（如肿瘤）中miRNA的异常表达。经进一步研究分析并提出假设，包括c-Myb、 NF-Y、Sp-1、MTF-1和AP-2alpha在内的转录因子(TFs)是miRNA表达的主调节子(master-regulators)。因此，对调节miRNA的转录因子的研究将为miRNA关联疾病的治疗提供有效帮助。
关于miRNA功能的研究也正在进行中，寻找下游靶基因是发现miRNA功能的一个直接手段。植物miRNA与靶基因几乎完全配对结合，而且像小的干扰RNA一样可以结合于mRNA的任何区域，所以植物miRNA靶标基因的鉴定相对直接而容易。研究表明，植物miRNA大部分作用于与发育过程相关的转录因子，尤其与模式建立和细胞分化有关。与植物相比，由于miRNA与靶基因的不完全配对，在动物基因组中直接寻找就显得有些困难，但也有研究尝试依据其他特征用生物信息学查找，但总的来说仍需要实验检验。从仅有的例子来看，一个miRNA可调控细胞中与某一种物质代谢或信号转导途径相关的几种mRNA，这样更能有效地发挥作用。寻找miRNA的靶基因是目前功能研究的热点之一，因为这为揭示每一个miRNA的功能提供了必不可少的线索，从而为全面了解miRNA在细胞中的功能打下基础。