细胞培养完整手册（3）

范例：

T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。

活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59

死细胞数/方格：5, 3, 4, 6

细胞总数= 243

平均细胞数/方格= 60.75

稀释倍数= 2

细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106

细胞数 /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106

存活率：225/243﹦92.6 %

（三）MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。

l、细胞悬液以 1000rpm离心 10分钟，弃上清液。

2、沉淀加入 0.5－1ml MTT，吹打成悬液。

3、37℃下保温 2小时。

4、加入 4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。

5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计 570nm比色，酸化异丙醇调零点。

注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

附：

1、0.4%台盼兰染液配制：台盼兰 0.4克 加双蒸水至 100 ml。Cbeqe

2、MTT配制：MTT 0.5克，溶于 100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。

3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入 HCl使最终达 0.04mol/L。

细胞的冷冻保存

1.注意事项：

1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。

1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 ℃ 避光保存，勿作多次解冻。使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

1.4.冷冻保存之细胞浓度：

1.4.1.normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml

1.4.2.hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些ybridoma 会因冷冻 浓度太高而在解冻24 小时后死去。

1.4.3.adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Aden℃arcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。

1.4.4.other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymph℃yte须至少5 x 106 cells/ml

1.5.冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

1.6.冷冻方法：

1.6.1.传统方法： 4℃ 10分钟--->-20℃ 30分钟---> -80℃ 16-18小时（或隔夜）--->液氮槽vapor phase 长期储存。

1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3 ℃/分钟之速度由室温降至–120 ℃，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。

2.材料

2.1.生长良好之培养细胞

2.2.新鲜培养基

2.3.DMSO (Sigma D-2650)

2.4.无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)

2.5.0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)

2.6.血球计数盘与盖玻片

2.7.等速降温机(KRYO 10 Series II)

3.步骤：

3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10 ％，混合均匀，置于室温下待用。

3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。

3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

3.5.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 ℃ 10 分钟→ -20 ℃ 30 分钟→ -80 ℃ 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。

3.6.冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL

细胞活化、细胞复苏

1.收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。

细胞复苏的原则－快速融化：

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作

一、实验前准备：

1.将水浴锅预热至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

二、取出冻存管：

1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三、迅速解冻：

1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

四、平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min

五、制备细胞悬液：

1.吸弃上清液。

2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

六、细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。

七、培养细胞

将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。

初学者易犯错误：

1.水浴锅未预热或者未预热到37℃。

2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。

3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。

4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

（另：冷冻细胞解冻程序）

2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。

2.2.FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。

2.3.将培养基置于 37 °C水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取 出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。

2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取 10 ml培养基加至 T25或 T75 flask中。取出已解冻 之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混 合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。

2.5.对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。唯对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中,离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。收到T25 flask 细胞时， 处理方式为︰

（1）于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

（2）将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C， 并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依 一般培养方式再将细胞置入培养箱中或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。