离心机沉降系数测定

省部重点实验室

2012/12/22

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生命科学仪器综合讨论

离心机沉降系数测定
沉降系数测定是分析离心机最主要的用途。通常只需要几十毫克甚至几十微克样品，配制成1~2毫升溶液，装入分析池，以几小时的分析离心，就可以获得一系列的样品离心沉降图。根据沉降图可以作样品所含组分的定性分析，亦可以测定各组分的沉降系数和估计分子大小，作样品纯度检定和不均一性测定，以组分的相对含量测定。

1.原理　　沉降系数的测定原理就是在恒定的离心力场下测定样品颗粒的沉降速度。因为样品颗粒很小，不能直接看到它们的沉降运动，所以把离心时样品颗粒的界面移动速度看作是样品颗粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光学系统来记录界面沉降图。在沉降图中样品界面一般表现为一个对称的峰，峰的最高点代表界面位置。通常沉降系数测量精度为±2%,但是如果面界图型表现为不对称峰型，或希望沉降系数测量精度达到±1%或更小的情况时，按峰的最高点作为界面位置就不够了这时应该使用二阶距法计算界面位置。

2.沉降系数测定实例⑴样品：牛血清白蛋白⑵样品溶液与离心：按0.6%浓度将牛血清白蛋白溶于0.14M NaCl、0.01M磷酸缓冲液中，pH7.0。用12mm厚双槽分析池，一边加入溶液一边加入溶剂，约各0.3ml。分析池与平衡池平衡重量，使平衡池比分析池轻0.5g以内，然后分别装入分析转头。分析转头装于分析离心为什么，关转动腔，抽真空。开 Schlieren光光源，选择工作速度一60000转/分，离心室温。转动腔达到真空后离以机开始运转加速，此时在观察窗口可以看到离心图型。达到工作速度后即为恒速离心。待看到样品峰的尖端后即可以6分钟间隔照相，共照6张。照完相即可关机，取出样品液，清理转头和分析池。照相用强反差显影冲洗后即得Schlieren光路沉降图形照片。⑶沉降图象测量：Schlieren沉降图可以用比长仪，读数显微镜，或投影仪测量。要求测量的横向量程为6cm，测量精度应优于10μm。通常读数显微镜已能满足要求。投影仪可以使图象放大于屏幕上，读测比较容易，眼睛不易疲劳。测量时把沉降图象的底片放于测量仪器上，使液面的垂直线与测量仪中的垂直线重合，然后用十字标线依次测量内参孔，液面，界面峰尖，和外参考孔的位置，每个图象至少读测三次，取平均值。依次把每个图象依同样方法测量，把数据列成表。照相号x1(mm) x2(mm) x3(mm) x4(mm) (x3-x1)/a log[5.65+(x3-x1)/a]
1 45.426 37.626 33.807 13.810 0.6125 0.7967
2 45.640 37.830 33.351 13.420 0.6485 0.7992
3 45.890 38.070 32.895 13.663 0.6854 0.8017
4 45.733 37.921 32.163 13.523 0.7161 0.8039
5 45.802 38.000 31.580 13.593 0.7507 0.8062
6 46.009 38.211 31.172 13.800 0.7830 0.8084

(4)沉降系数S的计算：沉降图测量完，先检查每一张图和第六张图的x2-x1值，二张图的x2-x1值的差应该小于界面峰位置的测量误差。实测x2-x1的差值为0.002，说明液面在离心30分钟内变动为 0.002mm。界面峰在30分钟内移动距离是第六号图的x1-x3减第一号图的x1-x3，是3.208mm,其峰位测量意味着允许为0.03。可内陆液面变动0.002mm远小于峰位测量误差0.03mm，说明离心时没有发生漏液。　　按a=(x4-x1)/1.7求算光路对分析池的放大倍数，然后按(x3-x1)/a求算界面峰离开内参考孔的实际距离，再按x=5.65+(x3-x1)/a求算界面峰离开旋转中心的实际距离，再由对数表求算logx植，计算数据亦列于表5中。

3.离心图象的分析　　当离心刚开始时如果见到有快速沉降的峰，几分钟内就到达分析池底部，一般多是由于样品发生部分聚合形成快速沉降的高聚物，如蛋白质样品液遇到某些变性因素时会部分变性而沉淀。离心达速后样品的的记心图象显示一个对称的峰形，一般可以认为样品是离心均一的。但是对样品的真正均一性还应用其他方法进一步检测，如电泳，层析等。某些混合样品偶然亦会给出一个对称峰的。峰形通常会随时间而扩展，这是由于样品扩散的结果。但如果峰形扩展很快，则该样品可能是多分散性的。如果离心图象中表现几个峰，说明样品中有几个组分，每一个峰代表相应组分的沉降界面，因此可以测定每一个组分的沉降系数值。根据峰的面积可以测量组分的浓度值。　　有时离心的图象表现出一个不对称的峰，这可能是由于下列几种情况所致。
①几个沉降系数接近的组分峰形重叠，
②样品是多分散性的，其分子量分布不均匀
③某些相互作用强的高分子，其沉降速度对浓度依赖很大，如DNA，多糖分子，若测定于高浓度，在界面区由于浓度变化造成沉降速度不一致而致峰形呈不对称分布。这类样品在更大浓度时甚至会形成一非常尖锐的界面，在离心沉降图中表现成一根垂直线，看不到任何峰形。根据这种图形测定沉降系数误差将很大。通常这类样品应该测定于很稀的浓度，此条件下分子相互作用变小，界面扩展的峰形，才可以测到正确的沉降系数。

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第1楼2012/12/22

4.样品的纯度和浓度测定
　　分析离心机可以测定样品的纯度和浓度，这亦是分析离心用途。通常样品的离心图形表现一个对称峰形时，可认为该样品是离心均一的。但是在作纯度测定时还要注意样品的测定浓度，应该使样品测定浓度大于测定方法的灵敏度一百倍以上，测定才有意义。譬如Schlieren光路对该样品测定灵敏度为 0.1mg/ml，那么该样品测纯度时的浓度应该是90mg/ml。假如选用样1mg/ml浓度测定，沉降图形即使表现单一峰，仍不能确定其纯度是0%还是99%。如果样品是多组分的，离心图中表现几个峰，根据每个峰的面积与所有峰的总面积的比值可以得到每个组分的相对浓度值。在计算时应该考虑辐射稀释效应，即把各个组分的面积值根据其所在位置用辐射稀释公式校正到液面处的值，然后计算相对。还要注意这样的浓度估测是建立在各个组分具有相同的折射率比值的假设基础上的。根据峰形面积结合该组分的浓度与折射率比值和仪器常数还可以计算该组扫的绝对浓度值。

5.带状沉降法
　　带状沉降法类似于速率区带离心法。方法使用合成界面池，在池中预先加入0.55ml的1M NaCl溶液，然后地2000转／分转速下铺上0.01ml样品液，然后加速到30000转／分，用吸收光路记录样品沉降图形。由于NaNl向样，品带扩散形成一密度梯度区，可以稳定沉降的样品区带。样品中如果有多个沉降系数不同的组分，它们将依各自的沉降速度呈区带沉降。利用这个方法可以检定样品纯度，估测组成的相对含量和沉降系数。适用于微量的核酸和病毒样品的分析测定。

离心机是利用离心力对混合液（含有固形物）进行分离和沉淀的一种专用仪器。实验室常用电动离心机有低速、高速离心机和低速、高速冷冻离心机，以及超速分析、制备两用冷冻离心机等多种型号。其中以低速（包括大容量）离心机和高速冷冻离心机应用最为广泛，是生化实验室用来分离制备生物大分子必不可少的重要工具。在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，常使用过滤和离心两种方法。但在下述情况下，使用离心方法效果较好。
　　①　沉淀有粘性或母液粘稠。
　　②　沉淀颗粒小，容易透过滤纸。
　　③　沉淀量过多而疏松。
　　④　沉淀量很少，需要定量测定。或母液量很少，分离时应减少损失。
　　⑤　沉淀和母液必须迅速分开。
　　⑥　一般胶体溶液。