一则荧光PCR双标准曲线的问题

对于你的问题我有如下几点回答，可能有不对的地方，请大家指教：
1、判断标准曲线的好坏最直接的办法就是看R方要大于0.98，越接近于1越好，扩增效率大于80%小于120%，越接近1越好，根据你的A值得出的扩增效率在90%左右可以判断标准曲线是可信的。
2、平台期有下降的趋势可能是机器到后期不稳定造成的，跟体系没关系，不影响最后的结果定量。
3、每个曲线的扩增效率是不准确的，要根据最后得出的标准曲线算出扩增效率，有的机器直接给出，有的需要自己算。
4、你前面几个浓度大的出现CT值太早了，整个梯度稀释的标准品CT尽量控制在15~35之内，待测样品的CT值落在其范围内，这样的结果才会可信。建议前期多做几个浓度梯度，然后舍去不好的点。
另外有个疑问：用双deltCt法有扩增效率么？或者得出扩增效率有意义么？用这种方法的前提就是内参和目的基因扩增效率一本一致就行了，没有标准曲线哪里来的扩增效率呢？

谢谢你的回复，我用双delt做过一次，应该保证每个样本的扩增效率都一致吧在80%-120%之间吧，只有一致才能用双delt呢。我还有疑问，希望咱讨论一下
1，根据你的A值得出的扩增效率在90%左右可以判断标准曲线是可信的，是不是需要保证每一个孔的扩增效率要保持80%-120%呢？还是根据标准曲线算出来的扩增效率在80%-120%呢？

2，我是用的双标准曲线法，我也觉得前面几个浓度的CT值太小，是我的样品问题，还是浓度太大了？只要保证标准品的CT值在15-35之间就可以吗？

1、我不是很了解你的扩增仪是那个牌子的，我用的机器没有每个孔的扩增效率，只有根据扩增曲线得出的整个反应的扩增效率，可信的结果需要保证扩增效率在80%-120%，所以对于你说的每个孔的扩增效率需要保证在哪个范围内我确实没有什么概念。
2、我觉得是浓度大的问题，你可以尝试多稀释几个点从浓度最大开始稀释，比如稀释7个点或者更多，选择在15~35循环之内的出现CT值的浓度作为标准品，其他直接舍去，这样做出的结果才可信

谢谢1.我用的伯乐的机子。
2.我明白了目的的标准曲线，内参标准品的Ct值范围保证12-18吧，如果满足目的15-35，内参12-18的话，在同一块板上扩增的话，程序条件必定一样，能得出所想要的目的15-35，内参12-18吗？
3.双标准曲线的公式有什么要求吗？比如斜率接近-3.4