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用超声波破碎仪破碎大肠杆菌注意事项

北京星越生物

2013/04/01

用大肠杆菌表达外源蛋白，在进行超声波破碎之前，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
细菌沉淀直接加样品1 buffer，再加5μl的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率， pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。超声波破碎仪探头一定要接近底部，约1cm（推荐是距底部0.5mm）。功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。
2*破3s停10s，破碎20-30个循环观察效果。
3*探头位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。在超声波破碎时试着加大体积,振幅最好不要超过60%.
4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，通常方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。如果换用Branson超声波破碎仪来进行工作，由于热耗较小，停顿周期可适当减小。

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