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免疫组化标准操作规程(SOP)
省部重点实验室
2013/04/18
私聊
生命科学仪器综合讨论
关键词
免疫组化,抗原,一抗,二抗
目的:
蛋白物质的定性、定位检测。
背景知识:
20世纪30年代,随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用,组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu(高松英雄)和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法,以后的30年间,酶组织化学得到了飞速发展,高松证明了磷酰胺酶、ATP酶;Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。
此间,金属盐法,硫化钴法,偶氮色素法,偶氮色素四唑盐法(tetrazolium salts method)以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来,以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶,奠定了电镜酶组织化学(electron microscope enzyme histochemistry)基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法(Osmification method)进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。
1950年A. H. Coons等人提出了荧光抗体法,从而把免疫学引入组织化学实验中,后来P. K. Nakane,S. Avrameas 和L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察,创立了酶标抗体法,从而为组织化学开辟了新途径。
随着分子生物学的发展,1969年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上,开始探索原位杂交技术,经过30年不断应用、完善和发展,特别是探针制备与标记物两大关键技术的突破,目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域,显示出巨大的应用潜力。
现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科,经过近几十年的发展,产生了许多分支,如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之,现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围,无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。
原理:
理论基础是基于利用放射性核素和其他标记物(荧光素,酶, 重金属离子等)作为示踪剂,通过免疫亲和(抗原-抗体特异性结合)和核酸杂交(碱基配对特异性连接)途径,在组织切片或细胞涂片上,原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。
主体内容
(一)、仪器设备
1)18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉;
2)水浴锅
(二)、试剂
1)PBS缓冲液(pH7.2~7.4):NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。
2)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0,1000ml):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。
3)0.5mol/L EDTA缓冲液(pH8.0):700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4)1mol/L的TBS缓冲液(pH8.0):在800ml水中溶解121gTris碱,用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5)酶消化液: a、0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制。
6)3%甲醇-H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7)封裱剂:
a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0~9.5)等量混合;
b、油和TBS(或PBS)配制。
8)TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本;pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。
(三)、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前,应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1)组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟;
2)无水乙醇中浸泡5分钟;
3)95%乙醇中浸泡5分钟;
4)70%乙醇中浸泡5分钟;
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1)抗原热修复
(1)高压热修复 在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)。盖上不锈钢高压锅的盖子,但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡5分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后,去除热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5~10分钟,反复1-2次。适用的抗原有:AR,Bax,Bcl-2,C-fos,X-jun,C-kit,C-myc,E-cadherin,Chromogranin A,Cyclin,ER,Heat shock protein,HPV,Ki-67,MDMZ,p53,p34,p16,p15,P-glycoprotein,PKC,PR,PCNA,ras,Rb,TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃,消化时间约为5~30分钟;胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原,其中有:Collagen,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,GFAP,LCA,LN等。
3、免疫组织化学染色
SP法
1)脱蜡、水化;
2)PBS洗2~3次各5分钟;
3)3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟;
4)PBS洗2~3次各5分钟;
5)抗原修复;
6)PBS洗2~3次各5分钟;
7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8)滴加Ⅰ抗50μl,室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10)PBS洗3次各5分钟;
11)滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置,或37℃1小时;
12)II抗中可加入0.05%的tween-20。
13)PBS洗3次各5分钟;
14)DAB显色5~10分钟,在显微镜下掌握染色程度;
15)PBS或自来水冲洗10分钟;
16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化;
17)自来水冲洗10~15分钟;
18)脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2,室温封闭5~10分钟,蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时(4℃过夜后在37℃复温45分钟)。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃~37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC,20℃~37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
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