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“已知解离常数预测出峰顺序”答案大揭晓!!!

毛细管电泳(CE)

  • 前段时间开了一个讨论帖,推断缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、赖氨酸(K)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)的出峰顺序。原帖链接如下:

    节后第一讨论贴--已知解离常数预测出峰顺序!http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20130219/4574102/

    帖子的点击率说明还是有不少网友关注的,在此先谢过大家的捧场。该贴到目前为止共有两位网友参与讨论,并都给出了各自不同的答案。我的答案跟他们的相差比较大,特此摆出来跟大家分享讨论。说的不一定对,只是抛砖引玉,希望大家畅所欲言。

    以下讨论全部以CZE为前提,且GBE只有缓冲溶液,没有任何其他添加剂(如有机溶剂)。

    要预测出峰顺序,首先得弄清楚这个物质的酸碱性。如果是弱酸性物质,在羧基完全解离的情况下,物质带负电荷,则荷质比越大出峰时间越晚。如果是弱碱性物质,完全电离时物质带正电荷,出峰顺序正好反过来,即荷质比越大,出峰时间越短。

    另外酸性物质,pKa>pH时,羧基解离;碱性物质,pKa时,碱基解离。

    在此理论下,以上给出的所有氨基酸,带的电荷都是一样的:pH都大于pKa1,所以所有氨基酸的羧基均解离,带一个单位负电荷。而所给的pH也都小于pKa2K除外),所以氨基也都解离并带上一个单位正电荷。对于KpH小于pKa2,氨基没有解离,但是它有一个碱性的R基,并且pKR大于pH,所以也是带上了一个单位的正电荷。

    再者,该缓冲体系为碱性(pH9.0),且远远大于pKa1,所以氨基的作用占主导地位,也就是说,在这个buffer条件下,氨基的影响起主要作用,这些氨基酸所带的有效电荷应为正电荷。符合上面说的碱性物质出峰顺序的原则:即荷质比越大,出峰时间越短。

    荷质比从大到小为:VTL=IKFW,所以理论上的出峰顺序也是VTL=IKFW

    但是,但是!!!!!!

    大家一定要知道,K(赖氨酸)的侧链是这些氨基酸当中唯一呈碱性的(其他6个氨基酸的侧链均为中性),所以K一定是且必须是最后出峰!另外,我自己的实验经验,IL先出峰。

    所以,最后的出峰顺序为:VTILFWK

    注:以上讨论完全为原创也没有引用任何paper或书籍等理论,冒险大胆推断。有砖的尽管拍,没砖的就赶紧留个脚印表扬一下吧!

    -----------------------------------------------------

    下面附上两位网友的答案,感谢他们的积极参与!

    1 flysky97:

    对于赖氨酸pI>9.0 ,其他均<9.0 赖氨酸第一个出来;
    分子量由大到小(其倒数由小到大顺序)为:
    色W: 204.23
    苯F: 165.19
    赖K: 146.19
    亮L: 131.17=异亮I: 131.17
    苏T: 119.12
    缬V: 117.15

    我先猜一下顺序(不对莫怪):
    赖氨酸Lys
    色氨酸try
    苯丙Phe
    异亮氨酸iso
    亮氨酸leu
    苏氨酸thr
    缬氨酸val

    flysky97的推测跟我的正好完全相反,可能是没注意到物质的酸碱性问题,呵呵~

    -----------------------------------------------------------------------------------------------

    2 wy20071722

    这个东西我想可能跟质量的关系不大,应该主要跟阻力有关,因为如果力平衡的话,就跟质量没关系了。等电点不同,解离度不同。主要跟电荷和半径有关系。考虑解离度不同,顺序:


    异亮



    苯丙
    这个没有考虑和溶液缓冲离子的相互作用影响,像后面几个pH接近,特别像亮和异亮,可能分不开,不清楚他们之间分子大小和电动势的差异,有可能会出峰与预测相悖,但这样的话不相符的部分迁移时间应该是接近的。
    分离不同等电点的应该是用等电聚焦来做吧。
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  • flysky97

    第1楼2013/04/26

    呵呵,我能猜得完全相反也不容易呀……

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  • wy20071722

    第2楼2013/04/26

    我还是想争辩一下。我从等电点来考虑:在等电聚焦试验下,氨基酸应该停留在等电点的位置,也就是说在pI值时在电场的作用下是不移动的,这个时候认为氨基酸是中性的(把氨基酸作为一个整体考虑,不论个别基团)。那么当pH大于pI时,这是碱式解离受到抑制,酸式解离收到促进,解离产物带负电,pH-pI值越大,解离越完全,这个要具体查解离曲线了。这里我们假定当pH-pI大于3时就完全解离了,这个时候应该带上完全的负电,出峰最慢。在pH相同的条件下,pI值应该越小,pH-pI值越大,解离越完全,出峰越慢。(电渗流都是一样的,最终的有效淌度与解离度和绝对淌度成正比,这在陈义的书中有介绍),那么直接考虑pI值应该是越大出峰越快了。至于绝对淌度,在速度平衡的情况下,qE=6πηrV,并没有显示和质量有关,而是和场强、电荷、溶液黏度、离子半径有关,这从平衡状态下没有加速度就和质量关系不大来考虑也是合理的。至于质量,我认为需要从吸附、离子云效应考虑的时候才有关,这个大多数情况下大家都不考虑了。也因为这样,pI值在6左右的氨基酸应该主要跟离子半径有关,因为溶液黏度和场强都是相同的,而这部分氨基酸只带一个氨基和羧基,都解离完全,所带电荷都接近,所以出峰容易与预测产生偏差,分不开的可能性更大些。

    这里是把氨基酸作为一个整体来考虑,分开来考虑的话pI值接近的顺序可能会有差别,但其他的应该差别不大。

    不过话又说回来,有时候好像真的和质量是有关系的,真是叫人糊涂啊

    个人见解,欢迎拍砖。

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  • nini2006

    第3楼2013/04/26

    wy2007很enlighten啊,说的很有道理,我只关注了荷质比而忽略了等电点。原帖里面自己给网友的提示其实也有提示到等电点的,可是自己在整理这个答案的时候偏偏自己给忘了。

    不过,物质的出峰顺序机理真的是很复杂,除了你所关注的等电点问题,荷质比是一定不能忽略的。其实捷克Charles University的一个组早在05年就已经推出了一款叫做peakmaster的软件,只要输入buffer的相关参数,用这个软件就能够模拟出对应的谱图来。其中离子半径也是其中的一个重要参数。

    wy20071722(wy20071722) 发表:我还是想争辩一下。我从等电点来考虑:在等电聚焦试验下,氨基酸应该停留在等电点的位置,也就是说在pI值时在电场的作用下是不移动的,这个时候认为氨基酸是中性的(把氨基酸作为一个整体考虑,不论个别基团)。那么当pH大于pI时,这是碱式解离受到抑制,酸式解离收到促进,解离产物带负电,pH-pI值越大,解离越完全,这个要具体查解离曲线了。这里我们假定当pH-pI大于3时就完全解离了,这个时候应该带上完全的负电,出峰最慢。在pH相同的条件下,pI值应该越小,pH-pI值越大,解离越完全,出峰越慢。(电渗流都是一样的,最终的有效淌度与解离度和绝对淌度成正比,这在陈义的书中有介绍),那么直接考虑pI值应该是越大出峰越快了。至于绝对淌度,在速度平衡的情况下,qE=6πηrV,并没有显示和质量有关,而是和场强、电荷、溶液黏度、离子半径有关,这从平衡状态下没有加速度就和质量关系不大来考虑也是合理的。至于质量,我认为需要从吸附、离子云效应考虑的时候才有关,这个大多数情况下大家都不考虑了。也因为这样,pI值在6左右的氨基酸应该主要跟离子半径有关,因为溶液黏度和场强都是相同的,而这部分氨基酸只带一个氨基和羧基,都解离完全,所带电荷都接近,所以出峰容易与预测产生偏差,分不开的可能性更大些。

    这里是把氨基酸作为一个整体来考虑,分开来考虑的话pI值接近的顺序可能会有差别,但其他的应该差别不大。

    不过话又说回来,有时候好像真的和质量是有关系的,真是叫人糊涂啊

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  • nini2006

    第4楼2013/04/26

    影响出峰顺序的因素很多,wy2007所说的都在理。关键看什么因素在起主要作用。
    如果谁有兴趣的话可以做一下实验验证就可以知道,我们所提出的那么多依据当中,到底哪个因素在起主导作用。
    我所提出的这个假想的条件如果是UV detector的话根本做不了的,因为这些氨基酸没有紫外响应,要衍生。衍生后成了别的物质,上面所给的参数全部不能用了。用电导致化学发光或质谱等检测器的话,倒是有可能做到。

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  • beyond1977

    第5楼2013/04/27

    应助达人

    学习了,辛苦了

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  • leonqshen

    第6楼2013/08/10

    太技术贴了!看着晕人
    nini版主辛苦

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