用试剂盒方法(酶法)测定食品中葡聚糖含量(范本贴)

1实验部分
1.1 仪器与试剂
移液枪：北京大龙兴创，100μL,200μL,1000μL,5000μL
涡旋振荡器：北京大龙兴创MX-F
电热恒温培养箱：上海一恒，DHP9032
离心机：上海安亭TGL-60B
紫外分光光光度计：北京普析通用，UV-1900
试剂盒：megazyme,(1-3)(1-4)β-D-葡聚糖测试盒
醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠：均为分析纯
超纯水

1.2实验方法
1.2.1 溶液的配制
a.缓冲溶液的配制

磷酸钠缓冲溶液（20mM,pH=6.5):3.12g磷酸二氢钠溶解于900mL蒸馏水中，再加入100mM(4 g/L)NaOH，将pH调整到6.5，最后定容至1L。

醋酸钠缓冲溶液（50mM,pH=4):2.9mL冰醋酸溶解于900mL蒸馏水中，用1M的NaOH调整pH至4.0，最后定容至1L。

b.反应液的配制：

1#试剂：用20mL磷酸钠缓冲溶液分三次将1#瓶中试剂溶解洗涤转移到小烧杯中，分装到5ml的离心管中冷冻保存，此为地衣酶溶液

2#试剂：用20mL醋酸钠缓冲溶液分三次将2#瓶中试剂溶解洗涤转移到小烧杯中，分装到5ml的离心管中冷冻保存，此为葡萄糖苷酶溶液

3#试剂：用超纯水将3#瓶中溶液溶解洗涤转移到1L的容量瓶中并定容，用该溶液将4#瓶试剂转移到烧杯中，用几个250mL棕色瓶分装，冷藏保存，此为葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂混合试剂

c.标准溶液的配制：在3个干净的小样品瓶中分别移取3mL、2mL、1mL醋酸钠缓冲溶液，分别加入1mL、2mL、3mL的葡萄糖标准溶液（4#瓶，浓度100μg/0.1ml)，加上醋酸钠缓冲溶液和原葡萄糖标准溶液，得到浓度分别为：0μg/0.1mL、25μg/0.1mL、50μg/0.1mL、75μg/0.1mL、100μg/0.1mL葡萄糖标准溶液

1.3 标准曲线

在5mL离心管中加入0.1mL醋酸钠缓冲溶液、0.1mL葡萄糖标准溶液、3mL3#试剂，在45度的下培养15分钟，取出，测定510nm下的吸光度，得到浓度-吸光度的标准曲线。

1.4样品测定

(1):将样品研细，并用烘干法测定其水分含量
(2):精确称取0.1-0.2g样品，小心地放入25mL比色管底部
(3):加入1ml50%的乙醇溶液润湿样品后，加入5mL磷酸钠缓冲溶液，涡旋振荡
(4):在沸水浴中加热2分钟后涡旋振荡，继续加热2分钟，继续涡旋振荡均匀
(5):冷却到40度以下，加入0.2mL的1#试剂，放入培养箱，在45度下培养1小时
(6):培养结束后加入纯水至25ml刻度线，混合均匀后，在4000转速下离心10分钟
(7):在3个5ml离心管中分别加入0.1ml的样品上清液，1个作为空白管，加入0.1ml醋酸钠缓冲溶液，另外两个作为样品管，加入0.1mL的2#试剂，在45度下培养15分钟
(8):加入3mL的3#试剂，在45度下培养20分钟
(9):在510nm下用空白值归零，测定样品的吸光度，根据得到的浓度计算出样品中葡聚糖的含量

(10):计算结果：C*0.025*0.9/m*100%（湿基）

如果是要干基就再除以（1-水分%）

2结果与讨论

2.1条件选择：
没钱也没时间去做验证，就把几种标准方法凑了凑，有40度下培养的，有50度下培养的，就选了45度；培养15分钟或20分钟的就选最长的20分钟；
2.2线性：

拿葡聚糖做线性是很好的，第一次做就是0.9999，就是紫外的软件怎么只能选择单位而不能输入呢？没办法，虽然选了单位mg/L，结果还是用excel计算，每次输入样品重量(g),得到的浓度值，用公式算出多少就多少百分含量
比如说0.1982g,得到的浓度值0.9920，结果就是0.992*0.025*0.9/0.1982=11.3%
2.3重复性
重复性分三种:
2.3.1方法中第7步开始的两个重复性：非常好，有时经常一样，偶尔偷懒就取一个做了
2.3.2两个同时处理的平行样：研究人员认为挺准的，自己觉得很是一般。因为试剂盒太贵，时间太长，要用的东西太多，后来我就不重复了，让研究人员说哪个有疑问我就重做，他们基本都说很准，因为一次同样的一个样品两个编号的，一个测出12.4%，一个测出12.7%，他们说很好。
2.3.3长期重复性：当然不是为了论文而作，因为方法要求每次做一个标样，我第一次拿到的方法时8.0%标样就测出8.0%，结果第二次测出了7.6%，我找理由去测了有5%水分，折算成干基为8.0%，第三次拿烘干的标准品测出了8.4%，差点没晕过去，这种重复性是不是太让人崩溃了？

结论：
保存条件很重要，看着说明书一个个对着放，生怕试剂失效。
其实也有文献用类似方法的，但总提到酶必须要纯，于是乎还是信国外的试剂盒靠谱点吧
工作曲线线性很好，重复性不咋地，是个人原因还是试剂或天气原因？研究人员安慰我食品分析要求不高，但愿是真的

参考文献
AOAC 995.16
AACC 32-23.01
EBC 3.11.1

这是范本贴,先列好提纲占坑,我还有个非范本贴,把那个写好了在来这填坑,月底前完成,请耐心等待

期待楼主把原创发上来分享

应助达人

嗯，yao老师慢慢补充，如果没加入团队的话，可以重新发布加入，都没关系，审批的时候留下加入团队的就OK了。

撒叫范本帖哈，意思莫有补充全滴都叫范本？

就是按照大赛推荐的范本格式来写啊，很久没写了，想试一下还有没有这个严肃的态度来完成一篇类论文的帖子

会飞的猪猪(dyn1985) 发表:撒叫范本帖哈，意思莫有补充全滴都叫范本？

应助达人

有组没啊，没有给俺凑下数啊

应助达人

这一篇与“第一次用试剂盒方法（酶法）测定食品中β-葡聚糖含量的体会”内容一样吗？只是格式不一样？