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最好的仪器技术指标，不是最好的仪器

flyaway

2013/08/22

私聊

液相色谱（LC）

前言

看到论坛中的老多同学的一个帖子—“【讨论】【参数解读】超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱仪器性能和技术参数解读[/url]”，有感而发，兴起而作，唯愿能将我所了解的知识与各位分享。

Part I 指标，指标——你全信吗？

什么是UPLC，什么是UPLC最重要的参数？

2004年，Waters 的UPLC 推出并获Pittcon 2004金奖以来，UPLC 或者UHPLC、UFLC之类的概念层出不穷。但是UPLC是Waters的注册商标，所以如果用UPLC来代替所有类似产品，作为它们的总称，肯定是不够严谨的行为。但是顾及论坛中各位的阅读书写习惯,以下如果没有特别标出生产商的UPLC，均为对各厂家类似产品的泛称。

图1 U系列的色谱仪器

所谓UPLC，全称是超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid chromatography )。回顾历史，当年HPLC 开始被使用时，High Performance Liquid Chromatography 和High Pressure Liquid Chromatography 的称呼并存了若干年之后，高效液相色谱才逐渐取代了高压液相色谱成为HPLC的真正含义。由此可见，不管是HPLC还是UPLC/UHPLC，对于液相色谱，performance 应该是最重要的参数。盲目追求high pressure显然是舍本逐末的行为。

可能你所不知道的故事之一：回想当年，某公司在Waters推出UPLC后，在市面上营造一些它只是能够耐受高压力的错误理解，误导使用者，并推出了自己的RRLC与之抗衡，然后默默模仿，终于在6年之后才有了自己的UHPLC，加入了自己曾经不齿（其实是当时所不能）的产品行列……
所以追求超高效率应该是大势所趋，效率至上才是王道。

UPLC的指标参数的意义何在?

当年Waters首先推出UPLC的时候，提出了三个相对传统HPLC的优势 – “SSR”，也就是Speed，Sensitivity & Resolution, 其实这才是我们应该追求的标志性参数。盲目地追求厂商提供的指标，其实是陷入了误区，因为，据说，指标写得最好的是国产仪器，其次是岛津……

图2 SSR

而且，每当看到人们评论、比较一个特定的指标时，我总是深感无力。这个指标就是采样速率/采集频率。采样速率是会影响色谱峰的质量的，但是盲目追求超高的采样速率，其实是根本没有必要的。从色谱的角度来说，一个峰上有15-20个点即可被识别并用于定量，对于二极管矩阵检测器而言，15-20个光谱也足够进行纯度检查与谱库匹配的操作了。假设一个峰，从开始洗脱到洗脱完毕共花了1秒钟，那么20的采样速率已经使我们得到了20个点的色谱峰。如果将采样速率设置到80或者120，峰内点数增加4倍或者6倍，噪音点的也同样增加，信噪比反而下降；同时由于点数太多，色谱图的原始文件体积也成倍增加，导致读取色谱信息时软件反应缓慢；电脑硬盘中原始数据所占用的空间也变大。所以合适的就好，追求太高的采样速率不会对实际的色谱工作带来便利与好处。

看看某公司仪器的采集频率指标截图（图3）：

图3 某公司检测器的采集速率指标

再看他们公司的宣传手册上的色谱图（图4）:

图4 超快速分离实例

从宣传手册上摘录下的图应该比较有代表性，又根据色谱常识通常出峰较早的峰形比较尖锐，故可以目测一下第一个峰的峰底宽，大约是2个刻度，即0.2*0.1*60s=1.2s。可惜几乎所有的宣传资料上都不会写上采集色谱图所设置的采样速率。

如果各位有兴趣，也可以回顾一下，你的色谱峰的开始到结束时间到底是多少秒？如果不是在0.2秒内完成一个峰的话，100以上的采集速率就是鸡肋。

再补充一下，尤其是看到老多同学的帖子中引用的某公司的指标，“最大采集频率：≥100 Hz ”，更让人觉得搞笑。我不知道所谓的大于等于是多大，1000Hz能达到吗？10000Hz能达到吗？科学严谨的精神是真实的记录，而不是玩弄文字游戏。即便采集频率这个指标是个鸡肋指标，如果真的能实现100Hz以上的采集频率，大可直接写出来，也好过用大于等于的方式混淆概念。

要求能耐多少压力以上才算UPLC，真的是超过15,000psi才算吗？

到底这个UPLC的P表示什么，我在上一段文字中已经解释，performance是本质，pressure只是表面现象。不过，追求high Performance带来的困难就是要面对high presssure，因此一般来说，对于亚2um的色谱柱，系统应至少耐受10000psi以上的压力才行。但是目前各大仪器公司和使用者都好像以15000psi为入门指标了。

以我个人的使用经验，一般12000psi可以耐受大部分的试验条件，如果色谱条件更改导致压力再提升，色谱柱的寿命可能会受影响，可能得不偿失。对于绝大多数要进行成本核算的使用者来说，出峰速度提升0.1min和柱子一个月一换，哪个更重要？此外，你所用的所有的色谱柱都能耐受到15000psi的系统压力吗？

可能你所不知道的故事之二：当年某公司推出了自己的UHPLC，随之有一系列的色谱图证明自己的系统如何优秀，相对传统的HPLC有了多大的提升……系统是自己的，柱子是对手Waters的---因为在没有开发出合适的柱子之前，不是所有的柱子都能耐受15000psi以上的压力的。

即便所有的色谱柱都能耐受到15000psi，再提升压力限度，需要对系统进行改进，采用特殊的材质，这就意味着成本提升，价格更高。

泵系统控制精确的流速，相对标准偏差要求在多少之内才算稳定？梯度延迟多小才够？

泵系统的精度，在实际实验中,使保留时间RSD小于2%就行，但是显然大多数使用者希望精度更高。所以仪器厂商也提供了对应的指标（图5）：

图5 某公司关于泵的一些指标

关注哪些？

流速范围?我们可以问问自己，有多少个方法的流速是需要设置到小数点后第三位的？绝大多数方法的流速是1.0ml/min或者0.8ml/min之类的设置，小数点后两位的精度足够我们用了。

流速精度？目前大多数色谱软件识别色谱峰的保留时间窗都是5%。记得我曾看过一家外企药厂的内控标准，好像样品保留时间与标准品的偏差小于1%即可。这个差不多就是我看到的最严格的标准了。各位数学好的网友可以自己估算一下您的要求。

图6 某公司系统延迟体积的指标

梯度滞后体积，又叫延迟体积（图6），对于新开发的方法或者方法传递的要求而言，是越小越好。目前各厂家好像都能控制在500ul以下，甚至于100ul以下。

但是，请记住，如果你用的流动相里有FA或者TFA，<40ul的滞后体积，你就等着发愁吧！

进样器的指标

进样周期

图7 某公司进样器的进样周期指标

这个指标可以关注，如果你的分析运行都在1min就结束，那么25s的清洗时间占据了近25/（25+60）=29%进样-运行周期。如果你每针都是10min，25s/（600+25）s=4%。

不过，换个角度想一下，如果你每针真的都是1min的运行时间，所以某公司的号称5s的进样时间足够短了，可以替你每针省下20s也就是0.33分钟的时间，你也可以看看你每天有多少个样？十个样品还是上千个样品？

又及，如果真的是上千个样品，你的UHPLC自动进样器的样品盘能容纳多少个？是不是半夜还要回到试验室换一批样品才能回去睡个安稳觉呢？还是要雇几个人日夜倒班呢？

交叉污染的指标：

图8 某公司进样器的交叉污染指标

UPLC的高灵敏度对残留的要求更严格，并且在运行时间缩短的情况下如何有效地进行进样针、进样口、管路、阀之间的清洗，是个很严峻的问题。关注这个指标（图8）无可厚非，不过，关于进样残留交叉污染的问题，有条件的同学们都可以来做这样一个实验：用DMSO溶液为样品，进样5ul，随后连进10针甲醇溶液或者乙腈溶液，再查看一下色谱图，到了第几针的时候DMSO的峰完全消失？

真金不怕火烧，实践才知道性能是不是真的好。（如果有同学做了这个测试，别忘记告诉我一个结果。）

Part II 不看指标看什么？

我个人觉得，我们更应该关注的为了实现SSR, 各大公司所使用的创新设计，例如将管路变细变光滑减少涡流扩散与径向扩散；重新设计色谱柱与管路的接头以减少死体积；重新设计检测器的流动池，降低池体积提高灵敏度；与UPLC配套的色谱柱的种类、规格是否齐全……正所谓：外行看热闹，内行看门道。

管路与接头

我们首先看看常规的0.005英寸的管路（图9）与Waters UPLC 上的0.002英寸管路（图10）在显微镜下放大后的比较（遗憾的是从来没有听说过其它公司有类似的介绍或者图片）：

图9 常规的0.005英寸的管路放大图

图10 Waters UPLC的0.002英寸管路放大图

再看看各家仪器公司为了解决耐高压又要便于拆装色谱柱的接头设计：

图11 Waters的镀金手紧接头

Thermo/Dionex公司的手紧Viper 接头（图12）更是后来居上，能够耐受1200bar的压力，而无须使用工具拧紧。在出厂时即设定了不同长短的管路规格，使用时非常方便。

以上两家公司的设计都采用了镀金的螺丝，以期达到更好的密闭与耐压性。

图12 Thermo公司的Viper手紧接头

再看Agilent 公司的接头（图13），不知为何没有选择Waters和Thermo都选用的镀金螺丝，还是使用简单的不锈钢材质（降低成本？），并且还分为三个规格，感觉不同的柱子需要更换不同的接头，似乎还无法媲美Waters、Thermo接头的通用性。

图13 Agilent 适用于UHPLC的接头

千万别小看管路与接头，这些细节对柱效、保留时间的稳定性、线性、灵敏度都有很大的关系。

样品通量

前面说到如果有上千个样品的话，又希望一次性都放到进样器的盘子上，该怎么办？

可以选择Waters的样品组织器（图14）。我曾经见过一次，真的是很壮观啊！

图14 具备样品组织器的UPLC

如果使用96孔板，有11个位置可以放样品板1056个样品；使用384位孔板； 11个板位，就能实现放置4224个样品。最不济也能48*11=528。有了这个神器，才能真正实现高通量，至少你不用半夜赶到实验室换样品了不是？

配套的检测器

我不是很了解Waters最新推出的APC系统（图15），但是从我的角度看，Waters解决了示差检测器（RID）耐压与大体积流动池样品扩散问题，使之能够应用在超高效系统上，应该是很领先的技术。而且GPC实验是个漫长的过程，能够将其转移到超高效的领域，无疑是个巨大的进步。

图15 Waters APC 系统

目前，UPLC/UHPLC的检测器基本已经与HPLC一样，UVD、DAD、FLD、RID、ELSD、CAD、MSD都有了成熟的产品。

Thermo 所独有的CAD（电雾式检测器）检测器（图16），也是一个需要了解的好产品。作为一个通用性的检测器，这几年它的应用也越来越多。

图16 Thermo公司的特有的CAD检测器

二元还是四元?

现在的厂家都推出了二元高压和四元低压的系统，它们也是最常见的配置。我个人的想法是，对于LCMS联用的UPLC，二元足矣，当然四元更好。因为MS检测器特有的灵敏度与专属性，使得它对色谱部分不再要求苛刻的完全分离，加之MS对流动相的特殊要求（最好使用挥发性的盐），也对溶剂管路的要求减少了。

对于研发部门的使用者，例如方法开发时，四元泵相对来说比较合适，因为实验中可能需要多样的流动相组合。如果通过溶剂选择阀能够扩展到六元、八元，辅助以色谱柱切换阀，相信方法开发时会更有效率。

结语

对于大多数使用者来说，应该都是希望购买的不是最贵的，而是最合适的仪器。正如我本人，作为一个纯粹的LC的操作者，我比较偏重的的是系统的重现性、耐用性与灵活性等等，玩弄字面游戏，纯理想状态下的指标绝对不是我关心的重点。只有真正体现技术含量并且能为我们这些使用者带来好处的设计与细节，才是我们所要关注的。

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