液相色谱串联质谱法测定动物组织中大环内酯类药物残留量
摘要：采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱仪（LC-ESI-MS-MS），建立了猪肉中林可霉素、竹桃霉素、替米考星、泰乐菌素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素等7种大环内酯类药物残留的检测方法，试验中猪肉中大环内酯类抗生素的残留用乙腈提取，以罗红霉素作为内标，提取液用正己烷去除脂肪后浓缩，再用磷酸盐溶液溶解后，经HLB固相萃取柱净化，甲醇洗脱，洗脱液浓缩定容至1ml，供液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。本方法采用了10ug/kg,20ug/kg,100ug/kg，3个添加浓度，每个浓度6个平行样品，上述7种大环内酯类药物残留的回收率在75%~100%，相对偏差在1.51%~5.48%。
关键词：液相色谱串联质谱法；大环内酯类药物；猪肉；
1 引言
大环内酯类是由链霉菌产生的弱碱性抗菌素，作用于细菌细胞核糖蛋白体50s亚单位，阻碍细菌蛋白质合成，属于生长期抑制剂。对革兰氏阳性菌及某些革兰氏阴性菌有良好的抗菌活性，并有抗寄生虫的作用，此外近年研究中还发现本品对军团菌、严重的弯曲杆菌感染、艾滋病病人的隐孢子虫病等也有较好的疗效。本品吸取迅速，能广泛的分布于全身各组织，其中炎性体液中的药物浓度最高，主要经胆汁排泄。
动物源食品中大环内酯类抗生素残留的主要问题是引起过敏反应和导致携带耐药因子的菌株扩散。大环内酯类兽药由于药效好,已经广泛用于禽畜疾病的预防和治疗,其在禽畜组织中的残留问题不容忽视。因此对动物组织中大环内酯类抗生素进行快速、灵敏、可靠的分析,对于临床药学、生态环境和人类健康等都有重要的指导作用。本实验在国内外文献方法的基础上,建立了动物组织样品中大环内酯类药物多残留的液/质联用确证方法。为动物组织中大环内酯类药物残留的监督检验和国内的残留监控提供技术支持。
2 实验部分
1.1仪器与试剂
1.1.1试剂和材料
甲醇：德国默克，色谱纯。
乙腈：德国默克，色谱纯；
水：1.25L哇哈哈纯净水（杭州产）；
正己烷：Honeywell，色谱纯。
磷酸氢二钠：分析纯。
氢氧化钠：分析纯。
氯化钠：分析纯。
猪肉：取自养殖基地。
标准品：购置于DR公司,纯度>90%。
磷酸盐缓冲溶液（0.1mol/l）：6.0g磷酸氢二钠溶解于450ml水中，用氢氧化钠饱和液调PH=8，用水定容至500ml，现配现用。
标准贮备液：称取各标准品10.0mg，分别放于10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，4℃保存。
1.1.2仪器
液相色谱—质谱仪（LC-MS-MS） ThermoTSQ,ESI源、电子天平（美国奥豪斯）、旋转蒸发仪（瑞士Buchi）、冷冻离心机（德国贝克曼）、研磨仪（德国莱驰）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、棒状均质器（IKA T18）、涡旋混合器（IKA）。
1.2样品提取
称取5g试样，置于50ml离心管中，加入15ml乙腈剧烈震荡，离心，取上清液于另一离心管中，加入2.0g氯化钠和10ml正己烷，剧烈震荡离心，取中间乙腈层与另一离心管中，用氮气55℃浓缩至近干。
1.3 样品净化
用7ml磷酸盐缓冲液分两次溶解残液，HLB小柱用10ml甲醇、10ml水、5ml氯化钠溶液、5m磷酸盐缓冲液活化小柱，样液通过HLB小柱，用10ml水、5ml甲醇：水溶液（2：3）洗柱，弃去全部流出液，抽干，用10ml甲醇洗脱于锥形试管中，用氮气浓缩仪于55℃水浴吹至近干，准确加入1.0ml0.1mmol/l甲酸铵溶解残渣，过滤膜上机检测。
1.4 色谱-质谱条件
液相条件：C18色谱柱，流速0.3ml/min，流动相0.1mmol/l甲酸铵和乙腈梯度洗脱。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，喷雾电压、碰撞能量、气流量优化至响应最佳。
3 结果与讨论
3.1 质谱条件的优化
在ESI源下正离子扫描，根据不同化合物的响应和保留时间差异，确定喷雾电压、碰撞能量、对气流量进行优化，使响应达到最优。
定性、定量离子、碰撞能量如下：
注：罗红霉素为内标物
各个物质的出峰时间为：林可霉素3.23min，替米考星4.24min，克林霉素4.47min，竹桃霉素4.64min，泰乐菌素4.91min，吉他霉素4.92min，交沙霉素5.17min，罗红霉素5.27min。
3.2 线性方程
配置混合标准标准系列工作液，浓度为0，10.0，20.0，50.0，80.0，120.0，200.0ug/L。分别以选定的定量离子峰面积与内标物的峰面积的比值对浓度绘制标准曲线，7种大环内酯类药物在10.0~200ug/L的范围内呈良好线性，r2均大于0.99。
3.3 回收率试验
取同一批阴性样品，加入适量的混合标准液，使加标量在10ug/kg、20 ug/kg和100ug/kg三个浓度，每个浓度做6个平行，求其平均回收率，并计算批内相对标准偏差。
4 结论
试验证明本方法简便、快速、准确,方法的定量下限为10.0 ug/kg，高效液相色谱串联质谱法测定猪肉组织中大环内酯类抗生素残留达到目前国际上检测林可酰胺类及大环内酯类抗生素残留的先进水平,可用于猪肉中7种大环内酯类抗生素残留的确证检测。
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