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免疫沉淀反应(二)——琼脂扩散实验
省部重点实验室
2013/09/24
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生命科学仪器综合讨论
琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时,便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。
如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时,便依各自扩散速度的差异,在适当部位形成独立的沉淀线,因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。
一、单向琼脂扩散实验
1. 材料
(1)诊断血清(抗体:抗人IgG或IgA免疫血清)
(2)待检血清(抗原):人血清
(3)参考血清:全国统一人血清免疫球蛋白参考血清(批号不同,免疫球蛋白含量不同)。
(4)其它:生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。
2. 方法
(1)将适当稀释(事先滴定)的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。
(2)在免疫琼脂板上按一定距离(1.2~1.5 cm)打孔,见图1。
(3)向孔内滴加1:2,1:4,1:8,1:16,1:32稀释的参考血清及1:10稀释的待检血清,每孔10 μl,此时加入的抗原液面应与琼脂板一平,不得外溢。
(4)已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。
(5)测定各孔形成的沉淀环直径(mm),用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线,再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。
二、双向琼脂扩散实验
1. 材料
(1)诊断血清:兔抗人血清
(2)待测血清:人血清
(3)阴性对照血清
(4)其它:生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
2. 方法
(1)取一清洁载玻片,倾注3.5~4.0 ml 加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
(2)凝固后,用直径3 mm 打孔器,孔间距为5 mm。孔的排列方式如图2所示。
(3)用微量进样器于中央孔加抗体,于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡,以免影响扩散结果。
(4)加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24~48小时。
(5)结果观察:若凝胶中抗原抗体是特异性的,则形成抗原—抗体复合物,在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线,为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合,才能确定待检样品为真正阳性。
(6)结果分析:琼脂扩散结果受许多因素影响。
①抗原特异性与沉淀线形状的关系:在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时,则可出现两单沉淀线的融合。反之,如相邻抗原完全不同时,则出现沉淀线之交叉;两种抗原部分相同时,则出现沉淀线的部分融合。见图3。
②抗原浓度与沉淀先导形状的关系:两相邻抗原浓度相同,形成对称相融合的沉淀线;如果两抗原浓度不同,则沉淀线不对称,移向低浓度的一边。见图4。
③温度对沉淀线的影响:在一定范围内,温度扩散快。通常反应在0~37℃下进行。在双向扩散时,为了减少沉淀线变形并保持其清晰度,可在37℃下形成沉淀线,然后置于室温或冰箱(4℃)中为佳。
④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响:一般来说,琼脂浓度越大,沉淀线出现越慢。
⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响:抗原、抗体相距越远,沉淀线形成的越慢,所以在微量玻片法时,孔间距离以0.25~0.5 cm 为好,距离远影响反应速度。当然孔距过远,沉淀线的密度过大,容易发生融合,有碍对沉淀线数目的确定。
⑥时间对沉淀线的影响:沉淀线形成一般在1~3天出现,14~21天出现的数目最多。玻片法可在1~2小时出现,一般观察72小时,放量过久可出现沉淀线重合消失。
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