酒中抗氧化能力ORAC分析
1.实验原理
ORAC反应是一个经典的氢原子转移(HAT)的氧化过程。在实验条件下，一分子的AAPH失去一分子氮气，生成两分子AAPH自由基(方程1)。在空气中，生成的AAPH自由基很快与O2反应(方程2)生成相对稳定的过氧自由基ROO· 。荧光素的荧光衰退曲线表明过氧自由基对荧光素的破坏程度，在没有抗氧化剂存在的情况下，ROO·从FL获得一个氢原子(方程3)，致使荧光素的荧光衰退；在有抗氧化剂(ArOH)存在的情况下，ROO·从抗氧化剂获得一个氢原子，生成ROOH和一个稳定的抗氧化剂自由基ArO· (方程4)，致使荧光素被过氧自由基破坏的速率受到抑制(见图1)。
R－N＝N－R 2R· + N2 (1)
R·+O2 ROO· (2)
ROO· + probe (荧光素) ROOH + oxidized probe (失去荧光) (3)
ROO·+ArOH（抗氧化剂） ArO· + ROOH (4)
图1 ORAC检测示意图
2.实验方法
ORAC法即氧自由基吸收能力（又称为抗氧化能力指数），是一种测量不同食品抗氧化能力的国际通用标准单位，检测数值愈高代表其抗氧化能力就愈强。ORAC法适合抗氧化剂的高通量筛选，是目前评价抗氧化物质抗氧化活性的最为准确、灵敏度高、应用范围广的方法之一，目前国际上已经有很多商品的标签注明抗氧化能力（ORAC值）。
将空白、样品以及标准抗氧化物(Trolox)各20μL，分别与160μL荧光素溶液混合后37℃保温30min，然后再加入AAPH溶液20μL，迅速开始测定，利用荧光酶标仪配备软件记录荧光强度，初始荧光强度值记为f0，以后每隔一段时间测定一个点，荧光强度分别记为f1, f2 …，抗氧化剂作用下荧光衰减曲线下的积分面积，扣除无抗氧化剂的空白曲线下面积，得出抗氧化剂的曲线下净面积(Net AUC)。抗氧化剂的ORAC值是通过其荧光衰退曲线的曲线下净面积与标准抗氧化物质Trolox的曲线下净面积相比得出的，ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。
我们将以ORAC方法来验证，包括线性（定量限与检测限）、精密度与准确度、重复性与稳定性、回收率等。通过验证方法的可行性，以此来评价保健酒的抗氧化能力。
3.试剂溶液的制备
3.1磷酸盐缓冲溶液
3.1.1缓冲溶液储备液
0.75 M K2HPO4：130 g K2HPO4溶于1 LddH2O；
0.75 M NaH2PO4：90 g NaH2PO4溶于1 LddH2O
3.1.2缓冲溶液工作液
分别量取K2HPO4贮备液81 mL，NaH2PO4贮备液19 mL，混合后用ddH2O定容至1000 mL，这样得到75 mM，pH 7.4的缓冲溶液，冰箱下贮存。
3.2荧光素钠盐溶液
荧光素钠盐贮备液1：称取0.0456g荧光素钠盐定容到100 mL磷酸缓冲液，4℃黑暗贮存；
荧光素钠盐贮备液2：1000μL贮备液1用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存；
荧光素钠盐工作液：800μL贮备液2用磷酸缓冲液定容至100mL，4℃黑暗贮存。
3.3 Trolox标准溶液的配制
0.0125 g Trolox定容到50 ml磷酸缓冲液中，得到1000μM的贮备液，−20℃ 贮存。然后用磷酸缓冲溶液依次稀释成100，50，25，12.5，6.25μM的工作液。
3.4 AAPH溶液
0.414g AAPH完全溶于10mL pH7.4，75mM的磷酸缓冲溶液，即得153mM的溶液，冰浴保存。（8h的有效期，现配现用）
3.5 Uric acid溶液
称量0.01681g Uric acid定容至100 mL磷酸缓冲液中，再依次稀释，得到20、40、60、80μM的工作液。
3.6 Caffic acid溶液
称量0.02252g Caffic acid定容至100 mL磷酸缓冲液中，再稀释得到12.5μM的工作液。
4.数据处理
下图是各浓度梯度的Trolox标准溶液，以及没有添加自由基的FL荧光自然衰减对照(AAPH阴性对照)和没有抗氧化剂存在时的自由基作用对照(Blank)的荧光衰退曲线图如图2所示：
图2 荧光衰退曲线图
各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据与AAPH阴性对照空白荧光强度相比，折算成相对荧光强度f，以相对荧光强度采用近似积分法计算荧光熄灭曲线下面积(AUC)。通过每隔2分钟测定一次，连续测定2个小时得到的动力学图如图3：
图3 荧光强度动力学图
因此荧光衰退曲线下面积AUC可以近似看作各梯形面积之和，可以表达为：
AUC=0.5×(f0/f0+f1/f0)×ΔT+0.5×(f1/f0+f2/f0)×ΔT+...+0.5×(fx/f0+fx+1/f0)×ΔT+...+0.5×(fn-1/f0+fn/f0)×ΔT
=0.5×[2×(f0/f0+f1/f0+...+ fn-1/f0+fn/f0)-f0/f0-fn/f0]×ΔT
其中fn代表第n个测定点时的荧光强度， ΔT为相邻两个测定点之间的时间间隔，因本实验室ORAC测定方法中ΔT设定为2min，一共有61测定点，因此该公式可以简化为：
AUC=2×(f1/f0+...+f60/f0+f61/f0)-f61/f0+1
Trolox标准溶液曲线下净面积Net AUC的计算公式是：Net AUC = AUCTrolox − AUCblank ，通过以曲线下净面积Net AUC与浓度绘制Trolox的标准曲线（图4），得出标准方程Y=A+BX（X：Net AUC，Y：浓度）。
图4 Trolox标准曲线图
样品曲线下净面积Net AUC的计算公式是：Net AUC = AUC样品 − AUCblank ，计算样品的曲线下净面积Net AUC，将样品的Net AUC值带入Trolox的标准曲线即得浓度，再换算出最终浓度，即为以ORAC值，ORAC值以Trolox当量μmol Trolox equivalent/g (μmol TE/g)或μmol Trolox equivalent/L (μmol TE/L)表达。
5.方法学研究
5.1 线性、定量限与检测限
使用0、6.25、12.5、25、50、100μM的Trolox标准溶液进行试验，重复测量6次，绘制标准曲线，试验表明不同浓度的Trolox与Net AUC(曲线下净面积)相关系数都在0.99以上（见表1），曲线斜率平均值2.398±0.0765，说明不同浓度的Trolox与其Net AUC具有线性关系。
表1 Trolox标准曲线线性
次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | SD | %RSD |
斜率 | 2.3496 | 2.3517 | 2.367 | 2.3298 | 2.48 | 2.5097 | 2.398 | 0.0765 | 3.1923 |
相关系数 | 0.9994 | 0.9989 | 0.9983 | 0.9974 | 0.9979 | 0.9987 | 0.9984 | 0.0007 | 0.0721 |
检测限（LOD）是以3倍空白测得值的标准偏差除以校正曲线的斜率来计算，因此方法的检测限是1μM—3μM。
5.2精密度与准确度
使用20、40、60、80μM 4个不同浓度的尿酸测定6次，计算标准偏差SD、相对标准偏差%RSD、准确度，如表2：
表2 质控样（尿酸）的准确度与精密度
| 20μM | 40μM | 60μM | 80μM |
1 | 平均值 | 18.22 | 39.32 | 60.09 | 81.55 |
SD | 1.44 | 0.83 | 0.54 | 1.23 |
%RSD | 7.92 | 2.11 | 0.91 | 1.51 |
准确度% | 91.12 | 98.31 | 100.15 | 101.93 |
n | 3 | 3 | 3 | 3 |
2 | 平均值 | 20.72 | 41.67 | 62.76 | 81.14 |
SD | 0.80 | 0.59 | 0.23 | 3.09 |
%RSD | 3.86 | 1.41 | 0.36 | 3.81 |
准确度% | 103.58 | 104.18 | 104.61 | 101.42 |
n | 3 | 3 | 3 | 3 |
3 | 平均值 | 19.71 | 41.31 | 60.99 | 83.62 |
SD | 0.61 | 0.50 | 2.70 | 0.23 |
%RSD | 3.11 | 1.20 | 4.42 | 0.28 |
准确度% | 98.55 | 103.28 | 101.65 | 104.53 |
n | 3 | 3 | 3 | 3 |
4 | 平均值 | 20.37 | 42.19 | 63.07 | 82.96 |
SD | 0.59 | 0.19 | 0.080 | 0.25 |
%RSD | 2.92 | 0.44 | 0.13 | 0.30 |
准确度% | 101.83 | 105.49 | 105.11 | 103.70 |
n | 3 | 3 | 3 | 3 |
5 | 平均值 | 19.69 | 41.08 | 63.04 | 84.10 |
SD | 0.56 | 0.39 | 0.27 | 0.28 |
%RSD | 2.86 | 0.94 | 0.44 | 0.33 |
准确度% | 98.45 | 102.70 | 105.07 | 105.13 |
n | 3 | 3 | 3 | 3 |
6 | 平均值 | 18.76 | 40.85 | 61.21 | 83.19 |
SD | 1.17 | 0.18 | 1.51 | 0.16 |
%RSD | 6.26 | 0.44 | 2.47 | 0.20 |
准确度% | 93.79 | 102.13 | 102.02 | 103.99 |
n | 3 | 3 | 3 | 3 |
总体 | 平均值 | 19.58 | 41.07 | 61.86 | 82.76 |
SD | 0.86 | 0.45 | 0.89 | 0.87 |
%RSD | 4.49 | 1.09 | 1.46 | 1.07 |
准确度% | 97.89 | 102.68 | 103.10 | 103.45 |
从上表看出，4个不同浓度的尿酸，每次测量的准确度在91%-106%之间，总体上的准确度在97%-104%之间，而相对标准偏差%RSD都小于10%，说明方法测定的精密度与准确度都较好。
5.3稳定性
使用Caffic acid（12.5μM）测定9天，Net AUC(曲线下净面积)与天数的曲线图5：
图5 ORAC方法的稳定性
通过实验表明，测定的Net AUC(曲线下净面积)有一定的波动，总体上ORAC方法测定的稳定性好。
5.4回收率
选定一个酒体稀释梯度样品（1：80，批号2010060202），准确测定其浓度值为53.677μM。在10mL的容量瓶中分别加入400μL、500μL、600μL 1000μM的Trolox标准溶液，然后用其稀释梯度样品定容至10mL（即相当于分别加入40、50、60μM的Trolox标准溶液），测定各自的结果，如下表3：
表3 回收率试验
| 测得值μM | 实际值μM | 回收率% |
1 | 95.461 | 93.677 | 98.1312 |
2 | 101.647 | 103.677 | 101.997 |
3 | 107.917 | 113.677 | 105.337 |
结果表明，三个回收率分别为98.13%、102.00%、105.34%，说明此方法符合检测要求，适用于酒中的ORAC值的测定。
6.某酒体样品ORAC值的测定
选择三个酒体样品进行ORAC值的测定，结果如下表4：
样品批号：1# 2010060202 2# 2010060302 3# 2010060947单位均为μmol TE/L
表4 酒体样品ORAC
编号 | 1 | 2 | 3 | 平均 |
ORAC | SD | %CV | ORAC | SD | %CV | ORAC | SD | %CV | ORAC | SD | %CV |
1# | 5034.9 | 232.71 | 4.62 | 5116.2 | 391.32 | 7.65 | 4983.8 | 829.33 | 16.64 | 5045 | 484.45 | 9.64 |
2# | 4557.8 | 107.2 | 2.35 | 4633.1 | 273.27 | 5.9 | 5028 | 800.09 | 15.91 | 4739.6 | 393.52 | 8.05 |
3# | 5037 | 216.65 | 4.3 | 4924.6 | 228.85 | 4.65 | 5181.8 | 504.96 | 11.92 | 5047.8 | 316.82 | 6.96 |
1#样ORAC平均值为5045 μmol TE/L，2#样ORAC平均值为4739.6 μmol TE/L，3#样ORAC平均值为5047.8 μmol TE/L。
7.小结
从以上各项数据表明，该检测方法具有良好的精密度、准确度、稳定性，回收率在98%—106%之间，因此该方法适合样品中ORAC值的检测。
通过在试验中不断摸索，总结出以下在检测ORAC过程中要注意的事项：
① 由于AAPH自发分解产生自由基的速率主要取决于温度，而且活性非常强，因此AAPH溶液必须现用现配，配好的溶液要放在冰浴中保存，以免失效。另外在加入AAPH前微孔板要放在37℃保温30min，加入AAPH最好在1min内完成，这样可以减小试验误差；
② 因为荧光素钠盐的荧光强度对反应体系的PH值比较敏感，当pH低于7.0时，其荧光强度显著降低，因此所有试剂溶液都要以缓冲溶液配制，从而消除样品pH值对荧光素钠盐荧光强度的影响；
③ ORAC方法对温度非常敏感，整个微孔板控制相同的温度是最基本的，不同孔温度的变化都可能影响实验的重现性，因此为避免“边缘效应”，对于96孔板只选用里面的60孔进行实验；
④注意单位的换算，一般情况下液态样品用μmol TE/L，固态样品用μmol TE/g或μmol TE/100g表示；
8.参考文献
1. Dejian Huang, Boxin Ou, Maureen Hampsch-Woodill, Judith A. Flanagan, and Ronald L. Prior J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4437–4444.
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http://www.nutraceuticalsworld.com/March042.htm
4. Ou, B.;Huang, D.; Hampsch-Woodill, M. Patent Application Publication. Feb.15,2007.
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