| 今天又遇到一个问题：我做真核表达连的是pEGFP-c1真核载体，目的基因插在绿色荧光蛋白的后面，选的酶切位点是xholI 和BamHI 。为了酶切方便，我在上游引物的酶切位点后加入了一个“G”（引物序列：依次为：两个保护碱基--酶切位点---辅助酶切的碱基“G”---kozak序列-----目的基因序列： CC CTCGAG G gcCACC ATGAAATACACAAgc）。今天猛然想起可能有移码的可能，蛋白可能会不表达，或表达错误，所以重新看了看载体。发现从了绿色荧光蛋白的起始密码子（613-615）开始到xholI（算上xholI的6个碱基）之间共有736个碱基，加上一个“G”及kozak序列，则绿色荧光蛋白起始密码子到目的基因的起始密码子之间有743个碱基，不是3的倍数，会造成移码的。 可是，后来我又算了一下，如果引物序列只有酶切位点和目的基因组成，没有多出来的一个“G”和kozak序列的话，绿色荧光蛋白起始密码子到目的基因的起始密码子之间有736个碱基，也不是3的倍数。所以现在很迷茫，在考虑要不要重新设计引物了。 请大家务必要帮帮忙啊！实验室也没有可以咨询的人，导师对这个也不是很懂，只有求助于大家了！ |
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