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如何把液相做到“打游戏” 上海市食品药品检验所

省部重点实验室

2014/01/11

液相色谱（LC）

如何把液相做到“打游戏”上海市食品药品检验所谢沐风液相色谱仪是药物分析工作者最常用的“一门武器”。本人工作15.5 年，深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时，便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能，如能庖丁解牛般使用，便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。一、水相中的溶质溶解方式水相中需溶解的无机盐和表面活性剂等固体溶质，强烈建议采用加热法，不建议采用振摇、超声等方式。因此种方式的溶解，溶质可能处于“临界胶团浓度”，其后一旦遇到某特殊情形（如遇有机溶剂、温度剧降等），极易析出少量结晶；而一旦析出，便将损伤仪器和色谱柱，呈现泵头处析出“盐和白粉”的现象。二、流动相的配制与使用1. 恒度洗脱一定是将水相与有机相混合后、抽滤（使用混合型过滤膜），用一个管路（如A 管）泵入仪器，这是使用的一个原则性问题！切勿因节约有机相、便于摸索色谱条件等原因而使用两个管路（一个纯水相、一个纯有机相）抽入仪器，即便配制了脱气机。因此种情形极易造成水相中的盐和表面活性剂少量析出。剩余流动相完全可继续使用，密封后放置阴凉处；待下次试验时与新配制的流动相混合后抽滤即可。无需担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准等问题，这些皆为疑神疑鬼。实践是检验真理的唯一标准！实践吧~2. 梯度洗脱流动相配制最为科学的方式是：A 相为高比例的水相-低比例的有机相、B 相为低比例的水相-高比例的有机相（英国药典几乎均如此）；其次为：A 相为高比例的水相-低比例的有机相、B 相为纯有机相；最不科学的为：A 相为纯水相、B 相为纯有机相，如既有质量标准采用了此种方式，强烈建议改为第二种或第一种方式，否则基线漂移严重，难以进行稳定的杂质检测。梯度洗脱结束后，强烈建议经 5 分钟回到初始状态，再平衡5 分钟后开始下一针测定。这10 分钟的稳定极为关键。切勿短时间内回到初始状态，此举对仪器损伤较大。三、色谱柱的安装标准 SOP 应为：取A 管路放入流动相瓶中→ 拧松泵头 → 流速由 0ml/min 逐级升至10ml/min，观察尾液是否呈瀑布状流出，持续10 秒→ 拧紧泵头 → 流动相呈抛射状从安装色谱柱的一端喷出，观测是否呈抛物线状，持续5 秒→ 流速逐级降至 1.0ml/min → 安装色谱柱，待20 秒后，流动相从色谱柱另一端呈泉水状涌出，安装另一头→ 手握两端，拧紧。以上安装顺序遵循的是：逐级排放气泡和仪器内存留的洗液，使得安装后气泡极难混入。本人曾试验梯度洗脱连续一周，第一针与最后一针主成分保留时间相差在6 秒以内。四、试验后色谱柱的清洗1. 最为常用的C8 柱、C18 柱1.1 流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时继续冲洗 30 分钟，流速1.0ml/min，柱温保持试验时温度，即可。1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时先采用纯水（或含有2%甲醇），冲洗A 管路（试验采用哪个管路，就要从头到尾冲洗该管路），时间30 分钟（如流动相中有表面活性剂，适当增加时间），流速1.0ml/min，柱温可较试验温度高出5~10℃；随后更换成20%甲醇再冲洗30 分钟，流速1.0ml/min，柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗，实属画蛇添足，导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂，从而在泵头上、色谱柱中析出，也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000 元的色谱柱，正着用了四年、倒着用了两年（倒着用测非有关物质）。2. 其他类型色谱柱查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法，切勿盲动，否则导致色谱柱性能急剧下降。五、试验顺序工作流程应如下进行：(1) 0~2 小时配制流动相、对照品和供试品溶液等，切勿催促昨日试验同事。(2) 2~3 小时采用 A 管路注入流动相（B、C、D 管路从来不用，除非梯度洗脱才用到B 管路），平衡1 小时。如流动相中有表面活性剂，建议前一晚小流速过夜，第二天上班后将流速增至 1.0ml/min，平衡1 小时后即可开始做试验。(3) 3~5 小时测定空白溶剂，一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”，通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得，切不可设定得过小，使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害，弄得人很担心。(4) 5~8 小时配制完所有样品，预试了对照溶液和供试品溶液，设定好自动进样程序，程序最后一针设定为小流速过夜，紫外灯关闭。切勿设定为切换成B 管路洗脱，此举得不偿失！(5) 8~24 小时放心回家，让仪器自动进样，除非不稳定的样品（配制一份测定一针）。充分利用下班后的16 小时，做到从容不迫、镇定自若。如单位还无自动进样装置，强烈建议向领导申请购买，因一台自动媲美三台手动。(6) 第二天0~0.5 小时检查并计算昨晚试验结果，如发现不良记录，将流速增至1.0ml/min，平衡30 分钟后，测定重新配制的该份样品即可（同时回校对照一针）。无需全部重新测定，不要过度谨小慎微。(7) 第二天0.5~2.0 小时如上冲洗色谱柱，交给其后试验同事。六、液相软件的使用现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几，主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。强烈建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能，做到一劳永逸，让软件充分为工作所用。“磨刀不误砍柴工”：本人曾用20 分钟完成500 个溶出度样品数据处理，做出溶出曲线图。体会一下~七、其他1. 如需使用正相系统，一定要单独采用一台仪器（如二手的、较为破旧的、淘汰的等），切勿采用异丙醇转换，此举对仪器损伤极大，等于“自杀”！2. 正相所使用的流动相（如正己烷、环己烷等），无需抽滤，混匀超声后即可使用，“大道至简”。3. 柱温箱必须配制。如欲经济，可购买国产柱温箱。（欢迎众人补充完善……）2013 年12 月__

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ychli315

第1楼2014/01/11

胜读十年书啊

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jiangmengz

第2楼2014/01/16

貌似我QQ空间转载过这个来着……

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zhaohua8011

第3楼2014/01/19

总结的很好，但是一般单位没有固定仪器使用正反相，通常需要到系统！

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susu0524

第4楼2017/03/05

学习了，只是有些做法不知道合适不，我们单位一直都是先用10%甲醇水冲柱子之后直接过度到纯甲醇，看来这种做法有时需要改进一下。

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夏天的雪

第5楼2017/03/07

应助达人

可以啊，经常这么做的
susu0524(susu0524) 发表:学习了，只是有些做法不知道合适不，我们单位一直都是先用10%甲醇水冲柱子之后直接过度到纯甲醇，看来这种做法有时需要改进一下。

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苡蒙

第6楼2017/03/07

写的不错

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hnteng

第7楼2017/03/11

这个做法可以的。
不要认为这个楼主说的都一定对。
susu0524(susu0524) 发表:学习了，只是有些做法不知道合适不，我们单位一直都是先用10%甲醇水冲柱子之后直接过度到纯甲醇，看来这种做法有时需要改进一下。

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